微型薯蛭石基质中疮痂病原鉴定及菌药协同防治探索

邱雪迎，马丹丹，赵伟全，李寿如，贾景丽，刘大群，3

(1.河北农业大学 植物保护学院/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，河北 保定 071001； 2.本溪市马铃薯研究所，辽宁 本溪 117000； 3.中国农业科学院 研究生院，北京 100081)

马铃薯是位列小麦、水稻和玉米后的第四大主粮作物，在保证我国粮食安全和农业可持续发展方面具有重要作用。我国马铃薯的常年种植面积在560万hm2以上，总产量保持在9 000万t以上[1]，是世界生产和消费第一大国。随着我国马铃薯种植面积的逐年增加，病害对马铃薯生产的影响日益突出，其中马铃薯疮痂病作为典型的土传与种传病害，已在我国各马铃薯主产区普遍发生，呈现逐年增长的趋势[2]。目前已知马铃薯疮痂病可由多种植物病原链霉菌(Plant-pathogenicStreptomyces)引起，包括普通疮痂链霉菌(S.scabies)[3]、酸性疮痂链霉菌(S.acidiscabies)[4]、肿胀疮痂链霉菌(S.turgidiscabies)[5]等10余种致病种，且不同致病种间的生物学特征有较大差别[6]。马铃薯疮痂病的发生与生长环境有很大关系，尤其在重复使用蛭石为基质生产微型薯过程中，疮痂病的发病率很高，危害较重。有调查表明，在内蒙古18个种薯生产单位疮痂病的发病率高达83.0%[7]。尽管目前有些措施可有效预防微型薯疮痂病，如利用雾培法、无土栽培等方式生产，但由于对技术设施要求较高和需要投入生产成本较多，很多生产单位较难采用，因此，多数还是以蛭石为基质进行微型薯生产。鉴于目前尚缺乏防治蛭石基质中马铃薯疮痂病的有效手段，本研究对蛭石基质中的疮痂病原菌进行鉴定，针对病原菌筛选有效的抑菌药剂，并结合前期获得的生防制剂在蛭石苗床上进行菌药协同防治试验，旨在探索马铃薯疮痂病防治的新途径。

1 材料和方法

1.1 供试菌株和菌剂

供试菌株包括分离自辽宁本溪微型薯病斑上的疮痂病原链霉菌LNB-1、LNB-2、LNB-3，已全部完成柯赫氏法则验证，均为疮痂病致病菌株；疮痂病原链霉菌S.scabies的典型菌株CPS-1；生防菌剂ZWQ-1水剂为前期制备，活菌含量为1.0×109cfu/mL。

1.2 供试药剂

所用测试药剂共29种，具体信息见表1。

表1 29种药剂的有效成分、含量及生产厂家Tab.1 The active components,contents and manufacturers of 29 pesticides

续表1 29种药剂的有效成分、含量及生产厂家Tab.1(Continued) The active components,contents and manufacturers of 29 pesticides

1.3 微型薯疮痂病原菌的分子鉴定

采用CTAB法[8]提取3个菌株的基因组DNA，采用链霉菌16S rRNA基因的通用引物16S1(5′-CATTCACGGAGAGTTTGATCC-3′)和16S2( 5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC- 3′)扩增，将获得的片段交由上海生工生物工程有限公司测序。序列经校对后，在NCBI数据库中进行BLAST比对分析，选取相似性较高的菌株和疮痂病原链霉菌的典型菌株，利用MEGA 5.0软件对16S rRNA基因序列进行聚类分析，通过构建系统发育树对菌株进行分子鉴定。

1.4 皿内抑菌药剂与菌药协同组合筛选

采用纸碟法[9]进行皿内抑菌药剂筛选。将马铃薯疮痂病菌S.scabies菌株CPS-1制成105cfu/mL的孢子悬浮液，用微量移液器吸取30 μL涂布OMA平板，在培养皿中央放置直径6 mm的无菌滤纸片，分别将29种测试药剂用无菌水配制成不同初筛浓度(表1)，取5 μL加至培养皿的滤纸片上，于28 ℃倒置培养5 d后测量抑菌圈大小，每种药剂3次重复，以无菌水为对照。根据结果将活性较好的药剂稀释成不同的浓度梯度，采用纸碟法进行最低有效浓度测定(方法同前)。然后将有抑菌效果的药剂与ZWQ-1生防菌剂进行组合培养测试，确定可协同使用的药剂。

1.5 微型薯苗床防治试验

防治试验在辽宁本溪马铃薯研究所日光温室的微型薯扩繁苗床中进行，测试所用马铃薯品种为春季收获的尤金试管苗原原种，所用基质为春季使用过且有疮痂病发生的旧蛭石。每个苗床长8.0 m、宽1.5 m，每个小区2.0 m2。按照行距6.0 cm、株距5.0 cm、播种深度10.0 cm种植。选用室内药剂筛选中有明显抑菌效果的药剂进行处理，以清水处理为对照。在马铃薯齐苗后，株高8.0 cm左右开始施药，此后每隔7 d处理1次，共处理3次。每次处理时将药剂用10 L水充分溶解后灌根，其他管理照常，微型薯成熟后收获并分别调查发病情况。

马铃薯疮痂病分级标准：0级，薯块表面无病斑；1级，病斑面积占薯块面积≤5%；2级，病斑面积占薯块面积的5%～10%；3级，病斑面积占薯块面积的10%～20%；4级，病斑面积占薯块面积的20%～40%；5级，病斑面积占薯块面积的40%～65%；6级，病斑面积占薯块面积的65%以上。

发病率=发病粒数/收获小薯粒数×100%，病情指数=∑(病级粒数×发病级别)/(调查收获粒数×发病最高级别)×100，防治效果=(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100%。

2 结果与分析

2.1 微型薯疮痂病菌的分子鉴定结果

通过对疮痂病菌LNB-1、LNB-2和LNB-3进行基因组DNA提取，利用引物16S1/16S2扩增后，得到约1.5 kb的扩增产物，经回收测序和序列校对后，确定片段长度为1 460 bp。在 NCBI 数据库中进行BLAST分析发现，3个菌株与S.scabies最为相似，同源性均大于99%，通过构建不同疮痂病菌16S rRNA基因序列的系统发育树，确定获得的3个菌株均属于S.scabies(图1)。

A：16S rRNA基因扩增(M：Marker；1：LNB-1 菌株；2：LNB-2 菌株；3：LNB-3菌株)；B：系统发育树 A: 16S rRNA gene amplification (M: Marker; 1: LNB-1 strain; 2: LNB-2 strain; 3: LNB-3 strain)； B: Phylogenetic tree图1 疮痂病菌16S rRNA基因扩增及系统发育树构建结果Fig.1 16S rRNA gene amplification and phylogenetic tree construction of scab pathogen

2.2 室内抑菌药剂筛选结果

采用滤纸片法对29种药剂进行初步测试，发现对疮痂病菌CPS-1抑制效果较好的药剂有8种。对这8种药剂所含有效成分的最低有效浓度进行梯度筛选，结果表明，适乐时0.1 g/L的抑菌圈直径最大，为41 mm；其次为福美双0.35 g/L、百菌清0.28 g/L和72%农用链霉素0.56 g/L，其抑菌圈直径分别为39 mm、39 mm和36 mm；四霉素0.1 g/L、氰烯菌酯0.125 g/L、三唑酮0.1 g/L和亿度勇0.2 g/L的抑菌效果相对较差，抑菌圈直径分别为25 mm、24 mm、22 mm和14 mm(图2)；其余21种药剂抑菌效果很差。将获得的8种药剂与生防菌剂ZWQ-1水剂进行组合培养测试，结果表明，适乐时和福美双可以与生防菌剂共同使用。

2.3 微型薯苗床防治试验结果

将筛选到的菌药协同组合、其他抑菌药剂、ZWQ-1水剂、柠檬酸及农用EDTA等用于微型薯苗床防治试验。在收获前对植株生长情况调查(图3)发现，清水对照有较多植株枯死；ZWQ-1水剂和福美双+ZWQ-1水剂处理的植株长势良好；而72%农用链霉素、适乐时+ZWQ-1水剂、百菌清、柠檬酸和四霉素等处理均有部分植株出现黄化和死亡，但整体上植株生长状况好于对照区；农用EDTA、亿度勇、氰烯菌酯和三唑酮处理植株均有大面积死亡发生，分析原因可能与施药后未能及时冲洗掉叶片残留的药剂有关。疮痂病的防效评价是对新生薯块的发病情况进行调查，植株的损伤对防效的影响相对较小，因此试验可以继续进行。待微型薯全部收获后，对所有薯块进行统计分析的结果表明：清水对照薯块发病率为70.90%；适乐时+ZWQ-1水剂和福美双+ZWQ-1水剂处理的发病率分别为26.23%和30.83%，对病害的防治效果分别为72.60%和57.92%；ZWQ-1水剂、百菌清、四霉素和柠檬酸处理的发病率分别为47.47%、52.31%、62.16%和66.67%，防效均较低，分别为33.26%、23.68%、24.75%和19.11%；其余处理效果均很差(表2)。说明药剂适乐时和福美双与ZWQ-1水剂协同使用对疮痂病具有明显的防治效果，较具应用潜力。

A：褔美双0.35 g/L； B：农用链霉素0.56 g/L；C：适乐时0.1 g/L；D：四霉素0.1 g/L；E：氰烯菌酯0.125 g/L；F：亿度勇0.2 g/L；G：三唑酮0.1 g/L；H：百菌清0.28 g/L A: Thiram 0.35 g/L； B：Streptomycin 0.56 g/L；C：Shileshi 0.1 g/L；D：Fourmycin 0.1 g/L；E：Cyanenide 0.125 g/L；F：Yiduyong 0.2 g/L；G：Three azolone 0.1 g/L；H：Chlorothalonil 0.28 g/L图2 不同药剂对疮痂病菌CPS-1菌株的抑菌测试结果Fig.2 Antibacterial test results of different agents against the CPS-1 strain

图中为生长后期的植株长势与收获后随机抽取的新生微型薯样品，各处理分别为A：清水对照；B：ZWQ-1菌剂；C：72%农用链霉素； D：适乐时+ZWQ-1水剂；E:百菌清；F：福美双+ ZWQ-1水剂；G：柠檬酸；H：EDTA；I：四霉素；J：亿度勇；K：氰烯菌酯；L：三唑酮Picture shows the plant growth at the late growth stage and a random sample of new-born micro-potatoes taken after harvest. The treatments were as follows, A: Clear water control; B: ZWQ-1 water agent; C: 72% Streptomycin; D: Shileshi + ZWQ-1; E: Chlorothalonil; F: Thiram +ZWQ-1; G: Citric acid; H: EDTA； I: Fourmycin; J: Yiduyong; K: Cyanenide； L: Three azolone图3 微型薯收获时不同处理植株生长与疮痂病发生情况Fig.3 The plant growth and minituber scab occurrence state of different treatments at harvest time

处理 Treatments每升用量Dosage in 1 L各病级微型薯粒数Minituber number of each disease grade012 3456发病率/%Morbidity病情指数Disease index防治效果/% Control efficiencyZWQ-1水剂ZWQ-1 water agent0.25 L104252220186347.4729.9633.26b72%农用链霉素72% Streptomycin6.0 g281289521258.8234.4814.28c适乐时+ZWQ-1水剂Shileshi+ZWQ-15.0 mL+0.25 L90127454226.2312.3072.60a百菌清Chlorothalonil25.0 g10311231518163052.3134.2623.68bc福美双+ZWQ-1水剂Thiram+ZWQ-120.0 g+0.25 L8345778630.8318.8957.92a柠檬酸Citric acid150.0 g411818912111466.6736.3119.11bcEDTA 70.0 g201296781072.2240.749.24c四霉素Fourmycin5.0 mL28713855862.1633.7824.75bc亿度勇Yiduyong2.0 g2331384854.0038.0015.35c氰烯菌酯 Cyanenide8.0 mL94181588586.5746.52—三唑酮Three azolone6.0 mL4328661290.2463.82—清水对照Clear water control—559281729292270.9044.89

注：同列不同字母表示差异显著(P<0.05)。

Note:Different letters in the same column indicate significant difference (P<0.05).

3 结论与讨论

随着马铃薯种植面积的增加和多年连作，马铃薯疮痂病的发生日益加重，已成为马铃薯生产的主要问题。马铃薯疮痂病发生的隐蔽性较强，给防治带来较大困难。在以蛭石基质生产微型薯时，由于其形成的特殊环境非常有利于疮痂病发生，致使微型薯的发病率非常高。目前对该病害的发生机制和影响因素还不十分清楚，仅知其具有土传和种传病害的基本特征。对该病害的防治还停留在多方探索阶段，人们在抑菌药剂、施药方法及生物因子防治等方面进行了研究。李青青等[10]通过浇灌防治的方法发现，53.8%可杀得2000的600倍液对脱毒薯疮痂病的防效为51.37%，20%五氯硝基苯可湿性粉剂1 000倍液的防效为39.75%。于勤良等[11]发现，基质用氯化苦熏蒸处理，带病种薯播种前用0.1%对苯二酚处理30 min，防效较好。李玉聪等[12]获得1株对马铃薯疮痂病菌具有较强拮抗作用的甲基营养型芽孢杆菌(Bacillusmethylotrophicus)，并将其用于温室盆栽防治试验，测试其防效为40.27%～48.66%。刘萍萍[13]采用生防链霉菌CC5-6菌悬液在盆栽试验薯块形成初期灌根防治马铃薯疮痂病，防治效果为33.9%。奚启新等[14]发现，调节土壤pH值至5.0以下或7.69以上对疮痂病菌有一定抑制作用。此外，还有很多其他措施被用于探索马铃薯疮痂病的防治，如消毒、调节不同基质、施用生物有机肥等[15-19]。

尽管多种措施在马铃薯微型薯疮痂病防治方面已经取得一定的效果，但防效普遍不高，说明单纯利用一种措施防治很难达到理想的效果。此外，由于马铃薯疮痂病可由多种病原链霉菌引起，在防治中确定病原菌的种类是重要前提，以便开展针对性防治。因此，本研究中首先对微型薯苗床的疮痂病原种类进行了鉴定，确定为致病种S.scabies后再针对其筛选抑菌药剂，并结合前期获得的生防菌株[20]形成菌药协同组合，确定用量后进行苗床防治试验。结果显示，适乐时、福美双分别与生防菌剂ZWQ-1水剂的组合处理可显著降低疮痂病的发病程度，防效为72.60%和57.92%，而单纯使用ZWQ-1水剂的防效与其他报道的效果相差不大，为33.26%。此外，菌药协同处理对微型薯植株生长表现出较好的促进作用。说明在马铃薯疮痂病防治中将生防制剂和化学药剂恰当组合使用会取得防病、促生长的双重效果。本研究为马铃薯疮痂病的防治探索了一条新途径，具体菌药协同防病促生的原因和作用机制还有待进一步研究。