CASQ2和RyR2在二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常中的作用

胡夏韵， 苏丽萍, 路子扬， 刘 丽， 苏天园， 蒲红伟

(新疆医科大学1基础医学院， 乌鲁木齐 830011; 2第一附属医院病理科， 乌鲁木齐 830054; 3第三临床医学院，4公共卫生学院， 乌鲁木齐 830011； 4第一附属医院学科建设科， 乌鲁木齐 830054)

关键字： 二乙酰吗啡； 兰碱尼受体2(RYR2)； 肌集钙蛋白2(CASQ2)； 心肌细胞； 节律异常

二乙酰吗啡即海洛因碱，具有很强的依赖性，可对机体多种器官造成不同程度的损伤[1]。研究表明二乙酰吗啡成瘾对心血管系统有严重危害，可诱发各种类型的心律失常，造成细胞内钙超载，影响心脏正常生理功能[2-3]。心脏电生理活动与心肌细胞钙离子通道关系密切，钙离子通道是由多种钙依赖的调节蛋白调控，兰碱尼受体2(RyR2)存在于心肌细胞的内质网/肌浆网上(ER/SR)，它能迅速地将Ca2+从ER/SR中释放出来, 影响细胞内的钙稳态[4]；肌钙集蛋白2(CASQ2)即隐钙素、收钙素，是心肌细胞肌浆网上调控钙储存的主要结合蛋白，研究表明CASQ2可与RYR2直接结合调节细胞内钙信号转导[5]。本研究着重于兰碱尼受体2(RYR2)和肌集钙蛋白2(CASQ2)两个因子，探究这两个因子与二乙酰吗啡致心肌细胞自发性收缩节律和频率异常之间的关系。

1 材料与方法

1.1实验材料出生3日龄SPF级SD大鼠乳鼠，雌雄不限，由新疆医科大学实验动物中心提供。二乙酰吗啡(新疆维吾尔自治区缉毒总队提供)，D-Hank′S 液、胎牛血清、胰酶、Ⅱ型胶原酶、高糖培养基(DMEM)、青-链霉素、维拉帕米、5-溴脱氧尿苷、5%山羊血清、Actin单克隆抗体均购自Gibco公司；CASQ2和RyR2抗体购自Abcam公司；逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒、蛋白印迹法(Western blot)通用型二抗试剂盒购自Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 原代大鼠心肌细胞的体外培养 取3 日龄SD大鼠8只，在无菌条件下用75%酒精消毒皮肤30 s，沿左锁骨中线开胸，取出心脏。将每个心脏剪1/2，留下心尖部分，用4℃的D-Hank’S液清洗3次，去除残留血液。用眼科剪沿心尖部放射状剪成7～8瓣，加入0.08%胰蛋白酶,在4℃温度下低频震荡消化12 h后加DMEM液终止消化，弃上清液，加入0.1%Ⅱ型胶原酶，在37℃温度下低频震荡消化7 min，重复4次[6]。前3 d加入5-BrdU，培养5～6 d后细胞连成片状并以相同频率搏动，即可用于后续实验。将培养好的心肌细胞分正常对照组(N组)、二乙酰吗啡干预组(H组)、二乙酰吗啡加维拉帕米干预组(H+V组)3组进行后续实验(其中二乙酰吗啡浓度设定为10-4mol/L，药物作用时间均为24 h)。

1.2.2 Wester Blot检测CASQ2和RyR2蛋白的表达 收集不同组处理的细胞，RIPA裂解液提取细胞总蛋白，以5%牛血清白蛋白(BSA，fraction V)为标准蛋白进行每组蛋白定量。将20 μg蛋白样品上样于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，以湿转法电转移至PVDF膜上，5%脱脂牛奶在室温封闭1 h后加CASQ2和RyR2抗体(一抗1∶1 000)，在4℃冰箱过夜，取出，洗膜3次，然后加入二抗，37℃ 1 h，洗膜3次，显色[7]。图像处理仪分析CASQ2和RyR2蛋白表达情况。

1.2.3 RT-PCR检测细胞中CASQ2和RyR2mRNA的表达 用Trizol试剂提取心肌细胞总RNA，按照RT-PCR试剂盒(Takapa)说明扩增目的基因，测定CASQ2和RyR2mRNA的表达情况。CASQ2上游引物：5′-TGAGGAGCTGGAAGACTGGA-3′，下游引物：5′-ATCGTCGTCATCGTCATCGT-3′,RyR2上游引物：5′-CCAGTGGGACAGACTTGTGA-3′，下游引物：5′-GCCTTATCCATGCCCAGTAA-3′。取PCR产物10 μL，置1.2%琼脂糖凝胶电泳成像[8]。

2 结果

2.1心肌细胞形态学及节律改变

2.1.1 心肌细胞形态学改变 正常培养7 d后，通过荧光倒置显微镜观察，可见原代心肌细胞形态多样，呈三角形、长梭形和多边形等，包膜完整，细胞核圆形或类圆形，大小正常，核膜光滑，细胞间通过伪足相互连接，连接成片的细胞按统一节律搏动。在H组以及H+V预组中可见心肌细胞形态大小各异，细胞膜形态欠光滑，伪足减少甚至消失，细胞间连接松散，核膜皱缩，细胞核可呈不规则形，部分细胞可见核固缩，核碎裂以及核溶解。其在镜下超微结构符合心肌细胞凋亡的改变，表明二乙酰吗啡可诱导心肌细胞凋亡发生形态改变，见图1。

N组

H组

H+V组

图1各组中心肌细胞形态改变(×400)

2.1.2 心肌节律改变 在N组中，心肌收缩频率约110～140次/min，节律整齐。H组可见心肌收缩频率明显降低，约60～110次/min，可见部分细胞停搏，或出现心动过速、心动过缓、二联律、频发早搏等心律失常类型；在H+V组中心肌收缩频率约80～120次/min，部分心律失常节律消失,见表1。

表1 各组中心肌细胞自发性搏动频率/次

注：与H组相比，*P<0.05； 与N组相比，#P<0.05。

2.2WesterBlot检测CASQ2和RyR2蛋白的表达结果显示，与N组相比，H组中心肌细胞CASQ2和RyR2蛋白表达水平出现明显下降趋势，差异有统计学意义(P<0.05)，与H组比较，H+V组中CASQ2和RYR2蛋白表达则呈进一步降低，差异有统计学意义(P<0.05)，表明细胞内钙离子浓度对CASQ2和RYR2蛋白表达有影响，见图2、图3。

2.3RT-PCR检测细胞中CASQ2和RyR2mRNA的表达结果实验结果示，与N组相比，H组和H+V组中心肌细胞CASQ2和RyR2因子mRNA表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与H组相比，H+V组中CASQ2和RYR2 mRNA相对表达量较低，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

组别CASQ2 mRMA相对表达量RYR2 mRNA相对表达量N组1.24±0.130.88±0.07H组0.56±0.13#0.51±0.04#H+V组0.44±0.14#0.44±0.03#

注：与N组相比，#P<0.05。

3 讨论

近年来有关二乙酰吗啡对心脏微观形态结构的影响及作用机制逐渐引起一些学者的关注[9-10]。有学者研究发现，二乙酰吗啡可诱发心律失常，可引起心肌细胞收缩频率及节律发生异常改变[11-12]。但其作用于心肌细胞引起心律失常的机制有待进一步研究。

细胞膜表面钙离子通道的正常活动是保证心肌细胞正常心律的关键要素。钙离子是细胞内重要的第二信使，可介导参与多种信号转导途径，在阿片受体介导的信号转导中，钙通道是较为重要的途径[13-14]。并已证实阿片类药物可通过心肌细胞Ca2+的变化诱发心律失常[15]。然而，钙离子通道异常同样可以改变心肌节律，那么异常改变的钙离子通道是否是二乙酰吗啡致心律失常的主要因素还未明确。因此，研究钙离子通道改变及钙离子浓度变化对CASQ2基因和RyR2基因表达的影响，可对二乙酰吗啡致心律失常有较为全面的了解，并能进一步深入探讨其对心肌细胞钙离子通道影响的作用机制。

RyR2为心脏钙离子释放通道之一，主要在心肌表达。钙离子在心脏的兴奋收缩偶联中起着重要的作用。心肌细胞膜除极化引起电压依赖性L型通道开放，产生一个短暂钙梯度，触发肌浆网钙离子的释放[16]。cAMP依赖的蛋白激酶A或钙/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II导致RyR2磷酸化，激活RyR2通道[17]，使肌浆网内的钙离子大量释放，钙离子与肌钙蛋白结合，引起心肌收缩[18]。因此当钙离子浓度发生变化时，则会影响RyR2的表达，从而影响肌浆网钙离子释放通道和心肌细胞的正常生理功能[19-20]。CASQ即肌钙集蛋白，是肌浆网上调控钙储存的主要结合蛋白。CASQ1主要表达在快收缩骨骼肌，CASQ2主要表达在慢收缩骨骼肌和心肌[21]。CASQ不仅与钙结合，还通过三体蛋白(Triadin)和连接蛋白(Junctin)两种蛋白与RyR相互作用，调节SR的钙离子释放[22]。有研究证明在没有Triadin和Junctin的情况下，CASQ与RyR能够直接结合[23]。肌肉CASQ-RyR复合物在正常的钙信号转导中很关键。CASQ和RyR的相互作用由Triadin和Junctin介导。之前的研究表明CASQ2决定了心肌SR的钙储存能力，以及兴奋收缩耦联时从SR释放的钙量，发现CASQ2可促进钙流向SR内[24-25]。

在本次研究中，与正常对照组相比，单独使用二乙酰吗啡干预下以及二乙酰吗啡加维拉帕米干预下原代大鼠乳鼠心肌细胞形态及节律发生了一定程度的改变，表现为心肌自发性搏动频率减低，心律不齐等。而心肌舒缩等一系列活动均与细胞内钙离子含量密切相关，进一步证实了二乙酰吗啡可使心肌细胞内钙离子含量异常从而诱发各种心律失常。通过蛋白定量检测发现在单独二乙酰吗啡干预下，CASQ2和RyR2蛋白表达水平下调，提示这2个因子参与二乙酰吗啡致心肌细胞节律异常的过程。采用钙通道抑制剂维拉帕米作用于钙离子通道后，发现CASQ2和RYR2因子的表达与单因素二乙酰吗啡作用相比均呈现表达水平降低，表明钙离子通道抑制剂维拉帕米可进一步抑制CASQ2和RyR2参与的钙离子相关信号通路。以上结果表明钙离子信号通路相关因子CASQ2和RyR2与二乙酰吗啡致心肌节律异常过程相关，并且提示钙离子通道在二乙酰吗啡诱导的心肌节律异常过程中发挥着一定的作用。

本研究结果表明，二乙酰吗啡可导致一定程度的心肌损伤及节律异常，提示二乙酰吗啡可诱导心律失常的发生，CASQ2和RyR2因子参与了此过程，同时可作为钙离子通道候选靶基因，对法医病理解释病理尸体解剖中吸食二乙酰吗啡导致猝死的原因提供理论依据，为临床诊疗和预防寻找并确立新的治疗靶标提供理论基础。