响应面法优化复合酶解制取赤霞珠葡萄汁工艺

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(新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052)

赤霞珠(CabernetSauvignon)属欧亚种,别名解百纳[1],为酿酒葡萄,也可用以制汁,其出汁率高、糖度较高、酸度适当,酚类物质含量高,具有典型的滋味和香气为人所知[2]。

赤霞珠葡萄所含有的抗氧化活性功能成分物质以多酚类化合物(花色苷)为主[3]。国内外研究表明,在众多的植物多酚中,葡萄多酚抗氧化清除自由基的能力最强,其抗氧化能力为VE的50倍、VC的20倍。赤霞珠葡萄中存在的多酚类化合物包括花色苷类(花青素)、儿茶素类、原花色素类以及白藜芦醇等,具有抗氧化、抗动脉硬化、抗变异性以及抗癌、抗过敏、预防高血压、皮肤保健及美容等功能[4]。

赤霞珠葡萄的花色苷等酚类物质含量虽然丰富,但主要存在于皮籽中,受果皮组织和细胞的束缚,传统的处理方式很难将酚类物质活性成分最大程度地促溶到汁中,造成了葡萄皮中的功效成分随皮渣排出,形成资源浪费。同时,将葡萄果皮中的花青素等有效物质溶出是制约赤霞珠葡萄汁产业化发展的技术瓶颈。

葡萄皮细胞壁中含有果胶和纤维素等物质,致使细胞壁彻底破碎困难,果胶酶、纤维素酶、β-葡聚糖酶复合可将果胶类、纤维素类等物质充分降解,较单一酶处理,更有利于细胞壁破碎,提高出汁率[5],也有利于花色苷、原花青素等多酚类有效成分溶出。

本研究采用复合酶(果胶酶、纤维素酶和β-葡聚糖酶)对赤霞珠葡萄果浆进行处理,以葡萄汁的花色苷含量和出汁率为指标,研究不同酶解条件对葡萄汁的影响，并优化获得最佳的酶解工艺条件,同时用高效液相色谱法(HPLC)比较单一酶和复合酶分别处理对葡萄汁中原花青素含量的影响,旨在为葡萄汁的酶法处理工艺提供一定的理论基础和依据,同时也为提高葡萄果汁的营养价值提供重要的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

赤霞珠葡萄 摘自新疆五家渠地区新疆农业科学院葡萄种植基地,无病虫害及腐烂果,果实大小均匀,可溶性固形物含量为24 °Brix。

果胶酶(10000 U/mL)、纤维素酶(700 U/mL)、β-葡聚糖酶(5000 U/mL) 天津诺维信(中国)生物技术有限公司;原花青素标品(>98%) 上海永叶生物科技有限公司;甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯) 美国Sigma公司;3,5-二硝基水杨酸、结晶酚(分析纯) 天津盛通泰化工有限公司;正丁醇、硫酸高铁铵、氢氧化钠、酚酞、盐酸、氯化钾、葡萄糖、无水乙酸钠、冰乙酸、无水碳酸钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、无水乙醇(分析纯) 天津光复科技有限公司;没食子酸、福林酚(优级纯) 北京索莱宝科技有限公司。

FA2104N型分析天平 上海民桥精密科学仪器有限公司;YP2002型电子天平 上海越平科学仪器有限公司;FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;TGL-16G型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂;DZKW-S-4型电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司;TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;LC-16型高效液相色谱仪 日本岛津公司;MYP11-2型恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦仪器仪表制造有限公司;KUDOS型SK台式超声波处理机 上海科导超声仪器有限公司;N-3000E型阿贝折光仪 上海卓鑫科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 葡萄汁加工工艺流程 将新鲜的赤霞珠葡萄洗净后人工除梗、破碎、去籽,称取250 g葡萄果浆于烧杯中,放置于4 ℃冰箱,在自然pH条件下,经复合酶酶解处理后,压榨,过滤,得到赤霞珠红葡萄汁。

将上述所得红葡萄汁于8000 r/min的条件下离心20 min,收集上清液备用。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 复合酶添加量对葡萄出汁率和花色苷含量的影响 按照1.2.1方法所得葡萄汁,按果胶酶∶纤维素酶∶β-葡聚糖酶复合体积配比=1∶1∶1、酶解时间6 h,分别在复合酶添加量0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%条件下进行酶解,离心取上清液,计算葡萄出汁率并测定花色苷含量,确定最适复合酶添加量。

1.2.2.2 复合酶配比对葡萄出汁率和花色苷含量的影响 按照1.2.1方法所得葡萄汁,按复合酶添加量0.6%,酶解时间6 h,进行酶解,分别在果胶酶:纤维素酶:β-葡聚糖酶复合体积配比0∶1∶1、1∶1∶0、1∶0∶1、1∶1∶1条件下,离心取上清液,计算葡萄出汁率并测定花色苷含量,确定最适复合酶配比。

1.2.2.3 酶解时间对葡萄出汁率和花色苷含量的影响 按照1.2.1方法所得葡萄汁,按复合酶添加量0.6%、复合酶体积配比1∶1∶1,分别在酶解时间2、4、6、8、10 h条件下进行酶解,离心取上清液,计算葡萄的出汁率并测定花色苷含量,确定最适酶解时间。

1.2.3 响应面试验设计 根据复合酶解的单因素试验结果,以复合酶添加量、复合酶配比、酶解时间三个因素作为自变量,葡萄汁的出汁率和花色苷含量为响应值,采用Design-Expert 8.0.6软件中Box-Behnken中心组合试验设计三因素三水平响应面分析试验(见表1),优化葡萄汁的酶解条件。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Factors and levels table of response surface analysis

1.2.4 不同酶解处理对葡萄汁花青素含量的影响 分别称取4份250 g葡萄果浆,置于烧杯中,分别添加0.66%(m/V)的果胶酶、0.66%(m/V)的纤维素酶、0.66%(m/V)的β-葡聚糖酶、0.66%(m/V)的果胶酶:纤维素酶:β-葡聚糖酶复合体积配比(1∶1∶1),放置于4 ℃冰箱酶解6.3 h制备葡萄汁,经纱布过滤后离心取上清液,测定原花青素含量,比较不同酶处理对葡萄汁中原花青素含量的影响。

1.3 指标的测定

1.3.1 出汁率的计算 取W g葡萄经破碎,酶解,过滤后,称取剩下的葡萄皮渣为W1g,按式(1)计算:

式(1)

式中,W为葡萄质量,g;W1为葡萄皮质量,g。

1.3.2 总酸含量的测定 电位滴定法,参照《酿酒检测与分析》(第二版)[6]。

1.3.3 还原糖含量的测定 3,5-二硝基水杨酸(DNS)法,参照《果蔬采后生理生化实验指导》[7]。

1.3.4 多酚含量的测定 Folin-Ciocalteus 法测定,参照《GB/T15038-2006》[8]。

1.3.5 花色苷含量的测定 pH示差法测定,参照杨兆艳[9]的方法。

取葡萄汁1.0 mL,分别用pH1.0和pH4.5的缓冲溶液定容至10.0 mL,置于暗处反应1 h,用蒸馏水做空白,在520、700 nm处测定吸光度,根据Fuleki公式求出花色苷含量。

式(2)

式中,A为(A520 nmpH1.00-A700 nmpH1.00)-(A520 nmpH4.50-A700 nmpH4.50);MW为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的分子量,449.2;DF为稀释因子;ε 为矢车菊花素-3-葡萄糖苷的消光系数,26900;L为光程,1 cm;W为葡萄质量,g。

1.3.6 原花青素含量的测定 标准溶液配制[10]:将20 mg原花青素标准品用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中,制成2 mg/mL的原花青素储备液。准确吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL储备液,用甲醇定容于10 mL棕色容量瓶中。分别取1 mL溶液至于具塞试管中,加入0.2 mL硫酸高铁铵溶液(用2 mol/L盐酸水溶液溶解)和8.8 mL正丁醇,塞紧盖子,摇匀,100 ℃水浴加热1 h后取出，冷却至室温,正丁醇定容至10 mL,得到原花青素标准品溶液,经0.45 μm有机滤膜后,进行HPLC分析。

样品制备:1 mL葡萄汁用甲醇定容置10 mL棕色容量瓶,从中取1 mL溶液于具塞试管,其余步骤与标准品溶液相同,最后经0.45 μm有机滤膜后直接上机。

HPLC条件[11]:Pgrandsil-STC-C18柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),进样量20 μL,流速0.6 mL/min,检测波长280 nm,柱温:室温,流动相:甲醇∶乙腈∶水=75∶20∶5;以原花青素质量浓度(0.2～1.0 mg/mL)为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.4 数据处理

实验均为独立重复三次,实验数据采用SPSS 19.0软件进行显著性分析,用OriginPro 8.5及Excel 97-2003软件绘制图形。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 酶添加量的影响 由图1可以看出,葡萄汁出汁率和花色苷含量随着复合酶添加量的增加呈先升高后降低的趋势。当复合酶添加量达到0.6%时,葡萄汁出汁率和花色苷含量达到最大,分别为81.2%和212.275 mg/L,随后葡萄汁出汁率和花色苷含量开始下降。这是因为随着复合酶添加量的增加,酶与果肉细胞反应增多,胞内物质更容易溶出,葡萄汁出汁率和花色苷含量随之不断增大;当复合酶添加量超过0.6%时,葡萄果肉细胞过度酶解,造成多糖复合物解离,果汁中的糖类物质增多,果汁黏度增大,阻碍酶解反应的继续进行,果汁出汁率随之下降[12]。因此,选择复合酶添加量0.6%较为合适。

图1 复合酶添加量对葡萄汁出汁率和花色苷含量的影响Fig.1 Effect of compound enzyme dosage on yield and anthocyanin content of grape juice

2.1.2 复合酶配比的影响 由图2可以看出,复合酶不同添加比例对葡萄汁出汁率和花色苷的含量影响比较明显,当复合酶体积配比为1∶1∶1时,葡萄汁出汁率和花色苷含量达到最大,分别为81.4%和212.905 mg/L。这是因为复合酶体积配比为1∶1∶1时,水解环境中参与果胶反应和纤维素水解反应的酶分子均达到酶解结合反应体系的稳态,改变复合酶配比则会打破这种稳态的体系[13]。因此,选择复合酶体积配比1∶1∶1较为适宜。

图2 复合酶配比对葡萄汁出汁率和花色苷含量的影响Fig.2 Effect of compound enzyme proportion on yield and anthocyanin content of grape juice

2.1.3 酶解时间的影响 由图3可以看出,随着酶解时间的延长,葡萄汁出汁率和花色苷含量增大而后减小。酶解时间为6 h时,葡萄汁出汁率和花色苷含量最大,分别为81.6%和212.597 mg/L。酶解时间增加可以促进葡萄胞内物的释放,但是酶解时间超过6 h后并不能够增加出汁率和花色苷含量,原因是随着酶解时间的延长,葡萄汁与空气接触,花色苷不稳定易分解,含量呈先升高后降低趋势,从果汁营养和口感方面考虑,酶解时间过长会导致营养物质破坏严重,口感变差,同时也增加了果汁生产成本[14]。因此,选择酶解时间6 h较为适宜。

图3 酶解时间对葡萄汁出汁率和花色苷含量的影响Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on yield and anthocyanin content of grape juice

2.2 响应面试验

2.2.1 响应面试验设计及结果 应用Box-Behnken对赤霞珠葡萄制汁工艺进行响应面优化,分析具体试验方案及结果如表2所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and results

2.2.2 回归模型的建立及其显著性检验 通过Box-Behnken设计建立葡萄汁的出汁率(Y1)和花色苷含量(Y2)与复合酶添加量(A)、复合酶配比(B)、酶解时间(C)之间的回归方程分别为:

Y1=83.22+2.42A+5.26B+0.66C+0.23AB+0.23AC+0.45BC-3.16A2-1.68B2-4.09C2

式(1)

Y2=240.67+2.14A+17.12B+2.72C+0.68AB+0.36AC+1.35BC-11.74A2-5.33B2-14.56C2

式(2)

表3 回归模型及方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

由表3可知,在复合酶处理葡萄汁工艺参数中,在所选的各因素水平范围内,影响葡萄汁出汁率的各因素按主次顺序排列为:B>A>C,模型中B和C2的影响极显著(p<0.01),A和A2的影响显著(p<0.05),其他因素的影响均不显著(p>0.05)。影响葡萄汁出汁率的各因素按主次顺序排列为:B>C>A,模型中B、A2、B2和C2的影响极显著(p<0.01),A和C的影响显著(p<0.05),其他因素的影响均不显著(p>0.05)。

2.2.3 响应面交互作用分析 通过多元二次回归模型得到响应面图,响应面图形是响应值对各试验因素A、B、C所构成的三维空间的曲面图。在其他试验因素不变的情况下,考察交互项对响应值的影响,响应面分析图可用于评价试验因素对响应值影响的两两交互作用[15]。响应面坡度越陡峭,表明响应值对于操作条件的改变越敏感,该因素对响应值的影响越大,反之则表明影响越小[16]。由图4可知,交互项对出汁率和花色苷含量的影响中,各因素之间交互作用明显。

图4 出汁率和花色苷含量的响应曲面图Fig.4 Response surface graphs for the effects on yield and anthocyanin content of grape juice

2.2.4 最佳条件的预测及验证实验 利用Design-Expert 8.0软件进行工艺参数的优化组合,得到预测的复合酶处理的最佳工艺条件为复合酶添加量0.65%、复合酶配比1∶1∶1、酶解时间6.29 h,响应面有最优值,即出汁率的理论值为87.354%±0.149%,花色苷含量的理论值为(252.716±0.149) mg/L。为验证模型的有效性,考虑到实际情况,将最佳工艺条件修改为复合酶添加量0.66%、复合酶配比1∶1∶1、酶解时间6.3 h,在此工艺条件下,葡萄汁的出汁率为87.103%±0.471%,花色苷含量为(254.664±2.359) mg/L,说明响应值的实验值与回归方程预测值吻合良好,证实了该模型的可靠性,进一步说明通过响应面试验设计对复合酶处理葡萄汁的工艺参数进行优化是可行的。

2.3 酶处理对葡萄汁原花青素含量的影响

由图5可知,原花青素标准品出峰时间为3.781 min。根据1.3.6原花青素含量的测定方法绘制标准曲线见图6,得回归方程y=13443.71457x+135.38191,R2=0.9995。

图5 原花青素标准溶液HPLC色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of proanthocyanidin standard solution

图6 原花青素标准曲线Fig.6 Standard curve of proanthocyanidins

由图7可知,所得不同酶处理葡萄汁中原花青素的色谱峰尖锐,分离效率好,出峰时间都在3.8 min左右。根据图7中的峰面积,代入回归方程,得到原花青素含量。

图7 不同酶处理葡萄汁中原花青素色谱图Fig.7 The chromatographic diagram of origin proanthocyanidin of different enzyme treated grape juice

由图8可知,复合酶处理葡萄汁的原花青素含量显著高于单一酶处理(p<0.05),果胶酶处理葡萄汁的原花青素含量为0.172 mg/mL,纤维素酶处理葡萄汁的原花青素含量最小为0.105 mg/mL,且不同酶处理葡萄汁的原花青素含量之间存在显著性差异(p<0.05)。原花青素是多酚化合物,主要存在于赤霞珠葡萄的果皮中,果胶酶可以水解细胞壁和细胞间隙中的果胶,使细胞破裂,促使活性成分释放,降低果汁粘度,提高出汁率和营养成分[17],β-葡聚糖酶可以降解糖苷类化合物,同时还可以协助纤维素酶降解纤维素,纤维素酶可以使葡萄细胞壁及细胞间质的纤维素、半纤维素发生降解,将三种酶复合使用可以促进赤霞珠葡萄有效物质原花青素的溶出[18]。

图8 不同酶处理对葡萄汁原花青素含量的影响Fig.8 Effect of different enzyme treatments on the proanthocyanidin content of grape juice

3 结论

本研究以赤霞珠葡萄为原料,通过单因素实验和Box-Behnken试验优化工艺参数,得到最佳酶解工艺条件为:复合酶添加量0.66%、复合酶配比1∶1∶1、酶解时间6.3 h,在此工艺条件下,葡萄汁的出汁率为 87.103%±0.471%,花色苷含量为(254.664±2.359) mg/L,表明响应面设计所得结果准确可靠,该模型可用于葡萄汁加工过程中葡萄色素溶出效果的分析与预测。

通过比较单一酶处理和复合酶处理葡萄汁的原花青素含量可知,复合酶处理葡萄汁的原花青素含量最大为0.224 mg/mL,显著高于单一酶处理(p<0.05),所得实验值与理论值相对误差小,说明经响应面分析方法优化获得的工艺参数是可信的,具有较好的实用价值。