菊芋菊糖粗提液的微生物除杂

李雪雁，武晓尧，孙春丽，谢辉灿，王金龙

(兰州理工大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州，730050)

菊芋(Jerusalemartichoke)块茎中菊糖含量为其干重的55%～83%，是自然界已知含有菊糖的36 000种植物中含量最高的植物之一[1]。菊糖，又称菊粉，是由呋喃构型的D-果糖经β-(2,1)糖苷键脱水聚合而成的果聚糖混合物[2]。不同聚合度的果糖具有不同的生理功能，低聚合度的果糖可以促进人体肠道双歧杆菌的增殖，改善肠道功能，提高免疫力和抗病力[3-5]。

由于菊糖易溶于水，加热溶解更快[6]，因此工业上提取菊糖一般都采用热水浸提法，在提取过程中一些杂质如蛋白质、果胶、色素等也随之被提取出来，因而菊芋粗提液需进行脱色、脱蛋白等去杂过程[7]。目前脱蛋白主要采用Sevage法、三氯乙酸法、HCl法、石灰乳法、树脂纯化法等[8-12]。菊芋提取液中还含有果糖、葡萄糖等还原糖，要得到高纯度的菊糖，还需额外采用一些方法(如膜过滤等)将还原性糖去除[13-14]。由于现行菊糖的工业化生产工序较复杂，导致成本较高。基于微生物在生长繁殖过程中消耗糖类和蛋白质作为其碳源和氮源，因此将筛选的不降解菊糖的微生物菌株接入菊芋粗提液中，在适宜条件下培养，可逐渐将粗提液中的还原糖和蛋白质消耗，即可达到菊糖纯化和精制的目的，并使原工艺简化。将微生物用于菊芋提取液除杂的研究尚未见文献报道，本文对此进行了研究，以期为工业生产的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫皮菊芋20 kg，购于兰州市某市场。将新鲜菊芋洗净切片，于60 ℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥24 h，制得菊芋干片，备用；菌株,兰州理工大学生命科学与工程学院实验中心保藏的11株酵母菌菌株，分离自宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的葡萄果实表皮和根际土壤中[15]；菊糖,即菊粉，购自甘肃省白银市某菊粉生产企业。

YPD培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨20，pH 5.5。

产酶种子培养基，参照文献[16]略做修改：菊糖10，蛋白胨20，酵母粉10，pH 5.5。

产酶发酵培养基(g/L)[17]：菊糖30，蛋白胨20，酵母粉10，(NH4)2SO45，KH2PO43，pH 5.5。

WL营养培养基(g/L)[18]：酵母浸粉4，胰蛋白胨5，葡萄糖50，琼脂20，储液A(KH2PO45.5 g，KCl 4.25 g，CaCl21.25 g，MgSO41.25 g，定容至400 mL，按1∶25比例添加)，储液B(FeCl30.25 g，MnSO40.25 g，定容至100 mL，按1∶1 000比例添加)；储液C(0.44 g溴甲酚绿溶于100 mL体积分数50%乙醇溶液中，按1∶1 000比例添加)，1×105Pa灭菌20 min。

牛血清蛋白(BSA，生物试剂)，考马斯亮蓝(优级纯)，蔗糖、果糖、酒石酸钾钠、3,5-二硝基水杨酸、苯酚、蒽酮等试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

WPL-125BE型恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；UV-3000PC型紫外分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；TGL-16型高速冷冻离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；FA2004型分析天平，上海良平仪器仪表有限公司；SHB-111型真空抽滤泵，天津赛得利斯实验分析仪器制造厂；GZX-9030MBE型电热恒温鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株鉴定及其菊粉酶活力的测定

1.3.1.1 菌株初步鉴定[19]

将11株酵母菌分别转接至WL鉴别培养基，28 ℃培养5～7 d，依据各菌株在WL培养基的菌落形态和颜色特征等，参照WL培养基的酵母菌鉴别表，进行初步鉴定。

1.3.1.2 菊粉酶粗酶液的制备

将11株酵母菌菌株分别接入YPD培养基中，28 ℃活化培养24 h；之后转接入产酶种子培养基中，28 ℃恒温振荡培养12 h；再将种子液转接入50 mL产酶发酵培养基中(接种量为10%体积分数)，30 ℃恒温振荡培养96 h。将发酵液在3 500 r/min，离心15 min，取上清液即为粗酶液。

1.3.1.3 菊粉酶活力的测定

首先参照文献[20]制作标准果糖曲线。

将粗酶液经适当稀释后取1 mL，加入20 g/L菊糖(用0.2 mol/L，pH 4.5醋酸缓冲液配制)4 mL，50 ℃下反应30 min，沸水加热5 min灭酶活，采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS比色法)[16]测还原糖，以沸水浴加热10 min失活的粗酶液作为对照。在果糖标准曲线上查出糖含量，计算反应生成的还原糖量(以果糖计)，以每分钟转化生成 1 μmol/L还原糖所需的酶量为1个酶活力单位，该法测得的是内切菊粉酶活力，以I表示。以2% 蔗糖代替菊糖，其他步骤同上。以每分钟转化生成1 μmol/L还原糖所需的酶量为1个酶活力单位，即为外切菊粉酶活力，以S表示。每个菌株实验结果取3次的平均值。

一般认为当I/S>10时，菊粉酶主要表现为内切酶活性，而I/S<10时，主要表现为外切酶活性[21]。

1.3.2 菊糖粗提液的制备

新鲜菊芋洗净切片，于60 ℃电热恒温鼓风干燥箱中干燥24 h，得菊芋干片。以粉碎的菊芋干粉为原料，菊糖热水提取条件为：料液比1∶15(g∶mL)、温度80 ℃、时间80 min，重复提取2次，经活性炭脱色，得菊糖粗提液。

1.3.3 酵母菌除杂实验

1.3.3.1 分析方法

总糖的测定采用硫酸-蒽酮法；还原糖测定采用DNS法；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法，以牛血清白蛋白绘制标准曲线[20]。

菊糖=总糖-还原糖

(1)

还 原糖脱除率/%=

(2)

蛋 白质脱除率/%=

(3)

菊 糖损失率/%=

(4)

1.3.3.2 单因素试验

将选取的菊粉酶活力较低的酵母菌株先用YPD培养基，28 ℃活化培养24 h，之后转接入已灭菌的菊糖粗提液中，28 ℃恒温振荡培养12 h，即为除杂酵母种子液。取40 mL菊糖粗提液于250 mL三角瓶中，经灭菌后接入体积分数3%除杂酵母菌种子液，对培养时间、温度以及摇瓶转速进行单因素实验，测定菊糖提取液中的还原糖和蛋白质的脱除率，确定3个因素的适宜条件。

1.3.3.3 正交试验

基于单因素试验结果，进行培养时间、温度及转速3因素3水平正交试验，进一步优化酵母菌除杂条件。按公式(5)计算:

×0.5

(5)

1.3.3.4 正交试验验证

以正交试验优化组合条件进行脱除还原糖和蛋白质的验证试验；同时对在优化条件下的菊糖损失率进行测定。

1.3.4 菌株的分类学鉴定

将菌株送到上海生工进行测序，引物用上海生工提供的酵母菌通用引物，得到菌株序列后使用Mega 5.1软件构建系统进化树将其进行进一步鉴定。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定及其菊粉酶活力测定结果

2.1.1 菌株初步鉴定结果

依据11菌株在WL培养基上经过5 d培养后所形成菌落的颜色和形态特征进行鉴定，其中4株为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，编号S-1-4；3株为有孢汉逊氏酵母(Hanseniasporauvarum)，编号H-1-3；4株为假丝酵母(Candidaspccies)，编号Z-1-4。

2.1.2 菌株菊粉酶活力测定结果

从表1可以看出，所有测试菌株的菊粉酶活力普遍低于一些文献报道[16-17,22-24]，因菊糖经过菊粉酶的水解作用可以产生果糖或低聚果糖，对于利用微生物去除菊芋粗提液中单糖的操作是不利的，故要选择菊粉酶活力较低的菌株。测定菌株中4株酿酒酵母的内切菊粉酶活力(I)均较其他菌株低，其中S-4菌株的I值最低，但其活力比值I/S<10，表现为外切酶活性相对较高，外切型菊粉酶水解菊糖的产物主要为果糖，对纯化产生不利影响，不适宜作为除杂菌株。S-2菌株的内切菊粉酶(I)活力仅高于S-4菌株而低于其他菌株，且其I/S>28，因此选择S-2作为除杂菌株进行以下试验。

表1 酵母菌株菊粉酶活力Table 1 Inulinase activity of yeast strain

2.2 单因素试验结果

2.2.1 培养时间对还原糖和蛋白质脱除率的影响

酵母菌培养时间对脱除还原糖和蛋白质的影响见图1。随着培养时间的延长，还原糖和蛋白质的脱除率逐渐提高，在50～60 h，脱除率基本稳定。由于菊芋热水粗提液中含有一定量的果糖、葡萄糖、低聚糖及蛋白质，可作为酵母菌的营养物质，在酵母菌生长繁殖的前中期，营养相对丰富，酵母菌生长速率较高，还原糖和蛋白质的消耗速率较快，表现为其去除率上升趋势明显，在40 h之后，糖和蛋白质逐渐被酵母菌消耗殆尽，脱除率即保持相对稳定；培养至70 h之后，还原糖脱除率基本稳定，而蛋白质脱除率略有下降，其原因可能是由于酵母菌开始老化，部分菌体自溶，菌体蛋白溶入提取液中，导致蛋白质含量略有增加。由此可见，控制适当的培养时间对还原糖和蛋白质的脱除是很重要的。

图1 培养时间对除杂的影响Fig.1 Effect of incubation time on impurity removal

2.2.2 培养温度对还原糖和蛋白脱除率的影响

温度对反应体系的影响是多方面的，既影响微生物的生长繁殖、酶的活性，也会影响反应体系的理化状态。通常酵母菌最适的生长温度在28～30 ℃，温度过低或过高，都会影响酵母菌的生长繁殖，由图2可知，30 ℃左右也是除杂效果较好的温度。随着培养温度的升高，一方面,酵母菌的生长将受到不利的影响，特别是在培养初期温度偏高还将导致中后期菌体早衰，还原糖和蛋白的脱除率呈现下降趋势；另一方面，菊粉酶适宜温度一般为50 ℃左右[25]，温度升高，酵母菊粉酶活性略有提高，菊糖水解产生少量果糖，在一定程度上使还原糖脱除率下降。

图2 温度对除杂的影响Fig.2 Effect of temperature on impurity removal

2.2.3 转速对还原糖和蛋白脱除率的影响

酵母菌为兼性厌氧微生物，溶解氧含量较高时酵母菌进行有氧代谢，产能效率较高，生长繁殖速率较快。摇瓶转速的高低直接影响反应体系的供氧量，由图3可知，随着转速的增大，溶氧量增加，酵母菌生长速率加快，还原糖和蛋白脱除率随之提高；但当转速在160 r/min以上时，酵母菌的生长繁殖速率趋于稳定，表明溶氧量已超过临界溶氧浓度，已不再是限制性因素，酵母菌对糖和蛋白质的脱除率也就基本稳定。因此摇瓶转速在160～180 r/min较适宜。

图3 转速对除杂的影响Fig.3 Effect of rotational speed on impurity removal

2.3 正交试验结果

正交试验结果及分析见表2、表3。

表2 正交试验结果与分析Table 2 Results of orthogonal tests and rangeanalysis table

注：综合评分采用加权评分法，分别把2项中最大的指标定为100分，权重系数均为0.5。

从表2和表3可以看出，酵母菌培养时间和温度对还原糖脱除率的影响极显著(P<0.01)，而摇床转速在140～180 r/min对还原糖脱除率影响不显著；3个因素对蛋白质脱除率的影响均极显著(P<0.01)。通过对还原糖脱除率和蛋白质脱除率的综合评分，3个因素的影响主次顺序为时间>温度>转速；较优组合为A2B2C3。

表3 正交试验方差分析结果Table 3 Result of variance analysis for orthogonalexperiment

2.4 正交试验验证结果

因酵母菌摇床培养时转速在160～180 r/min对脱除率综合影响不显著，故以较优组合A2B2C3和A2B2C2做进一步验证，结果见表4。A2B2C3组合的酵母菌还原糖和蛋白质脱除率分别达92.6%和93.1%，但菊糖损失率略高于A2B2C2组合。考虑到工业化培养微生物时，溶解氧常常是限制性因素，因此可选择溶氧水平较低的条件，即温度30 ℃、时间50 h、转速160 r/min，在此条件下，酵母菌对还原糖和蛋白质的脱除率分别为92.4%和92.9%，菊糖损失率为2.86%，除杂效果达到或优于其他方法[7,12,21-23]。

表4 正交试验验证结果Table 4 Verification results of orthogonal tests

2.5 分类学鉴定结果

从图4看出，菌株S-2与来自NCBI数据库的几种酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在一个进化分支上，并且在NCBI中的序列比对结果显示其相似性在98%以上，表明S-2菌株属于酿酒酵母。

图4 系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree

3 结论

本实验通过对11株酵母菌菌株的菊粉酶酶活力的测定与分析，筛选出1株菊粉酶活力较低的菌株S-2，且该菌株主要表现为内切酶活性。

在对影响酵母菌脱除还原糖和蛋白质的培养时间、培养温度及摇床转速单因素试验的基础上，进行了正交试验优化及验证，结果表明，在培养时间为50 h、温度30 ℃、摇瓶转速在160～180 r/min条件下，菌株S-2对还原糖的脱除率大于92%，对蛋白质的脱除率在93%左右，菊糖损失率低于3%。体现出脱杂效果好、菊糖损失少的优点，说明利用微生物脱除菊芋粗提液中的还原糖和蛋白质是可行的。

本实验所选择的除杂酵母菌S-2经系统鉴定为酿酒酵母，在食品生产中酿酒酵母已被美国FDA认证为GRAS菌株，不存在食品安全问题。除杂过程中培养产生的菌体可做进一步开发利用，或可通过微生物育种，选择菊粉酶活性低而菌体蛋白含量高的酵母菌株除杂，菌体可作为饲料蛋白添加剂使用。