电针“太冲”“百会”对自发性高血压大鼠肾组织ACE2、Ang(1-7)表达及Ang(1-7)/AngⅡ比值的影响*

袁静云，纪 智，王紫娟，张 跃，张 月，宋 军，李昇洙，刘清国

(北京中医药大学，北京 100029)

高血压病是一种严重危害公众健康的心血管疾病，2014年《中国心血管病年度报告》中指出，我国高血压病的患者数已达2亿，且近年来，我国因高血压导致的终末期肾病ESRD(end-stage renal disease) 逐年上升[1]。研究发现，肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensinsystem, RAS)在调节水盐代谢、维持血容量与血管张力以及调控心、肾脏功能等方面功效显著，且与血压的调节密切相关，RAS调控血压主要有两条通路[2-5],一条由血管紧张素Ⅰ(Angi-otensinⅠ，AngⅠ)、血管紧张素转化酶(Angiotensin-converting enzyme，ACE)、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)以及血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)组成的缩血管通路。ACE可分解AngⅠ生成 AngⅡ，AngⅡ与 AT1R 结合，整个过程具有促进细胞增殖、增加水钠潴留和强烈收缩血管等作用。另一条则是AngⅡ-ACE2-Ang(1-7)-Mas受体组成的舒血管通路，ACE2分解 AngⅡ，生成Ang(1-7)，Ang(1-7)与 Mas 受体结合，具有抗增殖、调节水电解质平衡、舒张血管和降低血压等作用。有报道称针刺可以有效改善早期肾损害的症状[6-9]，研究发现，捻转泻法可能通过降低SHR大鼠肾脏肾素和AngⅡ的含量从而对肾脏起到保护作用[10]。但目前针刺对肾RAS系统中舒血管通路的影响尚不明确。本研究通过观察电针“太冲”“百会”对自发性高血压大鼠肾组织ACE2、Ang(1-7)舒血管活性因子的表达和AngⅡ/Ang(1-7)比值的影响，探究针刺对肾RAS系统中舒血管通路的作用，进而探讨其对高血压肾损害的可能保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

SPF级自发性高血压大鼠(SHR)24 只，220～250 g，Wistar-Kyoto(WKY)大鼠 12只，体质量220～250 g。所用大鼠均为雄性，12周龄，购自“北京维通利华实验动物养殖中心[许可证号: SCXK (京) 2012-0001]。WKY大鼠12只作为空白组。利用随机数字表法将SHR大鼠随机分为模型组、电针组，每组各12只。整个实验过程中对动物的各项处理均遵照中华人民共和国科技部2006年颁布的有关动物的使用及伦理学规定。

1.2 主要仪器与试剂

汉医牌针灸针(北京汉医医疗器械)；韩氏穴位神经刺激仪：LH200H(联创科技集团南京济生医疗科技有限公司)；XH200型恒温式无创血压测量仪(北京众实科技有限公司);高速冷冻离心机(北京翔意信科数码科技有限公司)；BCA蛋白测定试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；蛋白裂解缓冲液(北京优科卓业生物有限公司)；VE186 TBC(上海天能科技有限公司)；均质器(Fluko)；电泳仪(DYCP-31E，北京六一厂)；电泳槽(北京君意东方电泳设备有限公司)；全自动多功能酶标仪(Thermo，USA)；电热恒温培养箱(天津泰斯特仪器有限公司)；ELISA定量检测试剂盒(杭州联科生物技术有限公司)；兔抗ACE2多克隆抗体(上海塞齐生物有限公司)；Leica UC7超薄切片机(德国徕卡公司)；2.5% Gluta电镜专用固定液(北京索莱宝科技有限公司)；HT-7700型透射电镜(日本 HITACH 公司)。

1.3 针刺方法

“太冲”“百会穴”，取穴参照《实验针灸学》教材大鼠标准穴位图谱定位(林文柱、王佩编)[11]，于后肢足背1、2趾骨凹陷处取太冲穴，于前正中线，两耳尖连线中点取百会穴，电针组大鼠采用0.18 mm×13 mm毫针分别于“百会”、双侧“太冲穴”直刺1～2 mm，太冲(右)和百会连接韩式电针仪两极，电流强度1 mA，频率2 Hz/15 Hz，留针20 min。针刺时间集中在每天上午8：00—11：00之间，连续治疗30天。模型组和空白组每日在相同时间进行与针刺组相同的捉抓固定刺激。

1.4 血压的测量

在室温(22±2)℃条件下，将清醒状态下的大鼠于36℃下预热约15 min，待大鼠状态稳定后，用无创血压仪测量大鼠安静、清醒状态尾压，连续测量3次，取其收缩压均值。血压每6天测量1次，即治疗前1天、治疗第6、12、18、24、30天时测量血压。测压时的注意事项：①正式测压前训练若干次；②实验室环境要保持安静；③测量过程中操作者应动作轻柔，以免因激惹大鼠而导致其血压波动；④大鼠网套大小要合适，以免逃脱；⑤加温时间不能太长，一般固定在15 min左右，以免使大鼠闷死。

1.5 检测方法

1.5.1 血清尿酸(UA)和尿素氮(BUN)及肾组织AngⅡ、Ang(1-7)的测定 离心机分离血清，使用全自动生物化学分析仪测定血清尿酸和尿素氮的水平。按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，根据标准品制作标准曲线，推测出各个检测因子的浓度。

1.5.2 Western blot检测肾脏ACE2的表达 将大鼠的肾脏提取总蛋白后，用BCA法测定并调整蛋白浓度一致，加入蛋白上样缓冲液，沸水中煮10 min使蛋白变性，5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗(Anti-ACE2)稀释比例分别为1∶2 000和1∶4 000，置于摇床4℃过夜。TBST洗涤3次，每次5 min，加HRP标记的二抗(1∶4 000)，室温摇床孵育1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，将条带置于化学发光成像系统,滴加ECL化学发光试剂进行曝光，条带运用Gel Image ststem ver.4.00(tanon,china)软件进行图像分析，计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度值，内参为GAPDH。

1.5.3 HE染色和Masson染色 肾组织4%甲醛固定，常规包埋，切成4 μm薄片，先后置于铁苏木素、丽春红酸性品红液、磷钼酸水溶液、苯胺蓝液浸染后脱水，二甲苯透明树胶封片，光镜下观察肾组织形态改变。

1.5.4 电镜观察肾脏结构 左肾靠近下极处切取约1 mm3大小的组织2～3块，2.5%戊二醛固定2 h后，以1%的锇酸·0.1 M磷酸缓冲液PB后固定2 h，以乙醇丙酮进行梯度脱水，812环氧树脂进行包埋，Leica UC7超薄切片机切60～80 nm薄片后，以2%醋酸铀酒精溶液和枸橼酸铅分别浸染15 min,最后将切片置于透射电镜下观察。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠治疗前后收缩压比较

治疗前模型组和电针组大鼠收缩压均高于空白组，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，模型组和电针组收缩压则无差异(P>0.05)，治疗24天后，电针组收缩压低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；治疗30天后，电针组、空白组、模型组两两之间有显著差异(P<0.01)，整体趋势模型组收缩压>电针组收缩压>空白组收缩压。见表1。

表1 各组大鼠治疗前后收缩压比较

注：与空白组比较，*P<0.01,**P<0.01;与模型组比较，△P<0.05,△△P<0.01。

2.2 各组大鼠尿酸、尿素氮水平比较

两两比较，将模型组与空白组血清中尿酸、尿素氮含量相比，模型组明显高于空白组，具有显著统计学差异(P<0.01)；电针组和空白组相比，尿酸、尿素氮含量均高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；电针组和模型组相比，电针组尿酸含量明显下降，差异具有显著统计学意义(P<0.01)，尿素氮含量也低于模型组，差异具有统计学意义(P<0.05)；总体结果显示，各组大鼠尿酸、尿素氮含量从大到小趋势依次是模型组>电针组>空白组。见表2、图1～2。

2.3 各组大鼠肾脏ACE2、Ang(1-7)、AngⅡ、Ang(1-7)/AngⅡ表达水平比较

与空白组相比，模型组肾脏ACE2、Ang(1-7)、Ang(1-7)/AngⅡ的表达明显降低，AngⅡ表达明显增加，差异有显著统计学差异(P<0.01)；经过电针治疗后，电针组和模型组相比，肾脏ACE2表达有所增加，差异有统计学意义(P<0.05)，Ang(1-7)、Ang(1-7)/AngⅡ表达明显增加，差异有显著统计学意义(P<0.01),AngⅡ的表达下降，差异有统计学意义(P<0.05)；电针组和空白组相比，ACE2的表达无统计学差异(P>0.05)。见表3、图3。

注：1.空白组；2.电针组；3.模型组。图1 各组大鼠尿酸水平的比较(μmmol/L)

注：1.空白组；2.电针组；3.模型组。图2 各组大鼠尿素氮水平的比较(μmmol/L)

组别n尿素(μmmol·l-1)尿素氮(μmmol·l-1)空白组660.56±15.977.30±0.71电针组6108.29±6.09∗△9.53±0.43∗&模型组6148.74±37.43#11.60±0.41#

注：与空白组比较，#P<0.01，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.01，&P<0.05。

2.4 各组大鼠肾脏病理变化比较

HE染色结果显示,空白组肾小球结构完整，球囊比例正常，肾小管排列紧密，间质无炎症细胞浸润；模型组大鼠肾小球囊腔扩张，肾小球萎缩变小，肾小管排列紊乱，上皮细胞空泡样变；电针组和模型组相比，肾小球毛细血管扩张，肾小囊扩张减轻，肾小管排列基本正常。Masson染色结果显示，电针组较模型组胶原纤维堆积程度减轻。电镜下观察空白组肾足细胞足突排列规则，各细胞器形态正常；模型组大鼠肾足细胞足突形态和排列不规则，融合明显，线粒体肿胀，有明显线粒体空泡现象；电针组和模型组相比，肾足细胞足突形态基本正常，融合程度减轻，线粒体肿胀现象不明显。见封三彩图4和图5。

表3 大鼠肾脏ACE2、Ang(1-7)、AngⅡ、Ang(1-7)/AngⅡ水平比较

注：与空白组比较，*P<0. 01,**P>0.05；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0. 01。

注：1.空白组；2.电针组；3.模型组。图3 电针“太冲”“百会”对SHR大鼠肾脏ACE2表达的影响

图5 电镜观察各组大鼠肾脏病理变化

3 讨论

我国是肾病的高发国家，其中由高血压引起的终末期肾病占了很大一部分比例，因此对高血压早期肾损害的干预防范显得尤为必要。现代研究及临床治疗时发现针刺可以对早期肾损害有一定的预防和治疗效果[12]。对于高血压肾病的预防和治疗，关键还是对病因的治疗，即对高血压的治疗。《内经》提出：“阳气者，大怒则形气绝，而血菀于上，使人薄厥”，临床上高血压早期发生的过程中，患者也多有急躁易怒，面红色赤等气血上逆的表现。因此临床治疗早期高血压时，也多选用从肝论治。“太冲穴”作为肝经的原穴，可以通过针刺直接对肝气进行调节，刘海华等[13]通过整理文献研究发现,太冲是治疗高血压的高频穴位，治疗效果肯定。实验所选用的另一个穴位“百会”，位于人体最高处，是督脉的要穴，也是手足三阳、督脉及足厥阴之会。一方面与肝经相连，可直泻肝气、平肝潜阳，使血压随着气血的平复逐渐恢复，另一方面，高血压的发生发展，其本质上是清阳不升、浊阴不降、阴阳失衡所造成的，而百会穴恰是升清降浊、开窍醒神、平衡阴阳的要穴。有研究发现百会穴确实对自发性高血压有一定的治疗效果[14-15]。“太冲穴”和“百会穴”一个在脚，一个在头，一上一下，共同起到调整气血平衡阴阳的功效。本次实验结果显示，经电针“太冲”“百会”治疗24天时，SHR大鼠的收缩压已经有一定程度的下降，30天治疗结束后，SHR血清中尿酸、尿素氮等早期肾损害指标有一定程度的降低；肾脏病理结果显示，电针组的肾脏损害程度较模型组有明显缓解，这说明电针“太冲”“百会”确实可以对早期高血压肾病有治疗和预防作用。

前期的一些实验已经证实,针刺可以降低AngⅡ的表达，AngⅡ是RAS系统中重要的收缩血管物质，研究发现高血压对肾脏的早期损害，主要是由血压的升高逐渐引起的肾小动脉硬化病变[16]，即主要体现在对血管上损害。RAS系统被认为是调节血管收缩的主要机制。研究发现[17-18],AngⅡ的含量与血管状态关系密切，AngⅡ含量的增高常会伴随肾小球硬化的发生，且AngⅡ的含量越高，肾纤维化的程度越高。ACE2一方面可以分解AngⅡ，减轻AngⅡ对血管的收缩和对内皮细胞的损伤，同时还促进NO的释放，发挥其扩血管、抗氧化应激及抗炎症功效，另一方面也可以竞争性地作用于AngⅠ,使之催化产生Ang(1-9),同时ACE2还可以下调AngⅡ受体1,削弱AT1R介导的病理性反应，另外还可降低醛固酮释放，对肾脏起到保护作用[19-20]。Ang(1-7)主要对血管起到舒张作用，对血管内皮细胞起到保护作用，Ang(1-7)/AngⅡ可能是反应血管收缩状态的重要指标，高血压引起的肾血管硬化可能和Ang(1-7)/AngⅡ的失衡有关。但针刺能否调节RAS系统中的舒血管因子的释放，从而对血压产生影响目前仍不清楚。

基于此，本实验通过探究针刺对肾RAS系统中舒血管通路的影响，进而探讨其对SHR大鼠肾损害的保护机制。此次结果显示，电针“太冲”“百会”可以使SHR大鼠肾脏ACE2、Ang1-7的表达有所增加，AngⅡ的表达有所下降，Ang1-7/AngⅡ比值增加。说明电针“太冲”“百会”可以促进SHR大鼠肾脏ACE2、Ang1-7的表达，同时抑制AngⅡ的表达，改善内皮功能和血管弹性，引起血管舒张，使血压降低，从而对自发性高血压早期肾损害有保护作用。