受体相互作用蛋白1在部分消化系统肿瘤中的研究进展

邱振东，王卫星

(武汉大学人民医院普通外科，消化系统疾病湖北省重点实验室，湖北 武汉 430060)

消化系统肿瘤的死亡率在过去十年中逐渐上升。分子流行病学证实，肿瘤的发生是一个复杂、多因素、多步骤的事件，其中环境因素与遗传易感性可能起着重要作用。然而其确切的机制尚未完全清楚。消化系统肿瘤因其化疗耐药和高复发率而预后差，其发生发展与各种刺激及由此引起的信号通路激活密切相关。受体相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)是炎症、细胞增殖与死亡等过程的关键调节因子，在多种肿瘤组织中存在异常表达。本文旨在综述近年来RIP1在消化系统肿瘤中的研究进展。

一、RIP家族及RIP1的结构

受体相互作用蛋白家族(receptor-interacting protein family, RIPs)是一类具有特异的丝氨酸/苏氨酸激酶活性的蛋白，是细胞应激的重要传感器，它们共享同源的N-末端激酶结构域，但具有不同的募集结构域[1]。在体外，RIPs可促进细胞凋亡、应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(SAPK/JNK)和核因子-κB(NF-κB)的活化[2]。RIP1是其重要一员，其N末端为丝氨酸/苏氨酸特异的激酶结构域，该激酶结构域可催化RIP1在丝氨酸/苏氨酸残基位点发生自磷酸化；C末端为死亡结构域(death domain，DD)，该结构域与Fas、肿瘤坏死因子受体1(TNF receptor 1，TNFR1)等密切相关。N末端和C末端之间是一段中间结构域，其中一段为同型相互作用模序(RIP homotypic interaction motif，RHIM)，约由35个氨基酸构成，能介导RIP1和RIP3同源性的相互作用，以激活下游信号通路[3]。

二、RIP1的生物学功能

1.RIP1与炎症 RIP1是一种重要的上游调节因子，调控炎症信号和多种细胞死亡途径的激活，包括凋亡和坏死。RIP1调节这些关键细胞行为的能力受到泛素化与去泛素化的严格调控。因此，RIP1的修饰可能提供了一个独特的“泛素密码”，从而决定细胞是否激活 NF-κB，以促进炎症信号[4]。有研究依此发现了新的炎症通路，在造血细胞中，受RIP 1调节的白细胞介素(IL)1α，可介导蛋白酪氨酸磷酸酶-1(SHP-1)突变小鼠模型的慢性炎症反应，而炎症小体与IL-1β在整个炎症过程中是非必须的[5-6]。

2.RIP1，Caspase-8与细胞死亡 RIP1在程序性坏死的过程中起到了适配器的作用。在TNF-α诱导的细胞死亡过程中，TNF-α及其受体首先形成一个三聚体，然后结合含有DD的蛋白质形成复合物，激活下游的凋亡途径。但当胱天蛋白酶-8(Caspase-8)活性被抑制，细胞就会进入程序性坏死途径。RIP1通过DD被招募到TNFR1，直接与TNFR1的DD结合，并被多种形式的泛素化激活[7]。RIP1的激活导致RIP3、混合谱系激酶结构域蛋白(MLKL)和Caspase-8的募集，形成一种被称为“坏死小体”的复合物。RIP3通过RHIM与RIP1相互作用，从而激活下游通路使细胞裂解[8]。RIP3激活了细胞代谢途径中的三种关键酶——糖原磷酸化酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸脱氢酶，导致活性氧(ROS)的过度产生，ROS引起DNA损伤、线粒体膜通透性损伤和溶酶体损伤，最终导致细胞死亡[9]。化疗药物能通过Caspase-8信号通路促进肿瘤细胞的凋亡，然而当Caspase-8的活性受到抑制，RIP1则介导程序性坏死从而阻断这一细胞凋亡途径，促进了肿瘤发生与发展。

TNF、Toll样受体(TLR)或T细胞受体(TCR)在Caspase-8的凋亡抑制作用下，也能诱导细胞膜裂解。RIP1缺乏的小鼠出生后不久死亡，而RIP3缺乏的小鼠出生后是健康的，并且RIP3缺乏症可改善小鼠心肌梗死、动脉粥样硬化等多种疾病模型[10]。在胚胎发育过程中，RIP1可以减少ZBP1/RIP3/MLKL依赖的程序性坏死的发生[11]。

3.RIP1与组织稳态 在胚胎发育、组织的动态平衡、免疫等过程中，程序性坏死已成为细胞程序性死亡的重要途径。RIP1是肠和皮肤上皮细胞存活、稳态和炎症的主要调节因子[12]。

RIP1的中间结构域是RIP1连接泛素化的关键，它与TAB2/TAB3/TAK1复合物、NF-κB关键调节器(NEMO)结合，从而激活NF-κB，在调节细胞生存、死亡和增殖等多种细胞事件中发挥重要作用[13]。Caspase-8通过平衡RIP1、NF-κB和JNK的激活，在肝再生过程中具有非凋亡功能。Caspase-8的缺失使NF-κB活化，从而促进肝再生。研究表明，Caspase-8和NEMO的共同缺失损害了肝脏的可控性再生反应，并导致肝肿大[14]。

三、RIP1与消化系统肿瘤

RIP1的泛素化及其介导的程序性坏死与肿瘤的发生发展密切相关。在肿瘤细胞中，肿瘤凋亡抑制因子1(cIAP1)和cIAP2能直接使RIP1泛素化，并诱导多泛素化后的RIP1发生构象改变，与TAK1(生存激酶1)结合产生效应，从而维持肿瘤细胞的存活。AE404030(一种以BIR结合四肽为模型的化合物)能与cIAP1和cIAP2结合，促进两者蛋白质体降解，导致RIP1泛素化的急剧减少，于是RIP1主要启动另一条信号通路，结合Caspase-8并诱导肿瘤细胞凋亡[15]。肿瘤早期分析表明，IAP拮抗剂促进了NF-κB信号蛋白(TRAF2、 NEMO等)的快速自动泛素化[16]。

RIP1在肿瘤生物学中的意义，已经在几种消化系统恶性肿瘤中进行了深入研究。肿瘤细胞类型的不同，RIP1对肿瘤的发生发展有着不同的影响。

1.RIP1与肝癌 肝癌细胞在对抗凋亡时Caspase-8的活性被抑制，Caspase-8不仅具有促进肝细胞凋亡的作用，而且在DNA损伤反应中具有非凋亡作用。通过参与DNA损伤反应，Caspase-8可能保护细胞免受不稳定增殖相关基因的影响，从而减少肝癌的发生。而一旦肿瘤形成，Caspase-8的低表达与人肝癌的低侵袭性行为有关[17]。

化疗药物β-拉帕酮可激活癌细胞的凋亡、自噬和坏死等多种细胞死亡机制。有研究表明，在人肝细胞性肝癌SK-Hep1细胞中，β-拉帕酮诱导了不依赖Caspase-8的癌细胞死亡，而且能增加癌细胞内碘化丙啶(PI)摄取和高迁移率族蛋白1(HMGB-1)的胞外释放，通过奎宁氧化还原酶1(NQO1)介导的RIP1-PARP1-AIF途径诱导了依赖RIP1的程序性坏死[18]。

此外，有研究根据大量临床数据分析，将Cullin相关NEDD8解离蛋白1(CAND1)的高表达作为肝癌病人预后不良的预测指标。CAND1沉默通过诱导Caspase-8/RIP1依赖性凋亡抑制肝癌细胞增殖[19]。

有肝癌小鼠和人肝癌病人的研究数据表明，RIP1的TRAF2依赖性抗肿瘤作用可能在小鼠和人肝癌发生中具有特殊的相关性。RIP1失活可诱导肿瘤坏死因子介导的肝细胞凋亡而不影响NF-κB下游信号的丢失。RIP1和TRAF2共同抑制肝癌的发展，两者在人肝癌中的低表达反映病人预后不良[20]。

2.RIP1与结肠癌 结肠癌对5-氟尿嘧啶(5-FU)的耐药性是其辅助化疗的关键难题。有研究表明，RIP1和TNF-α参与的程序性坏死性细胞死亡是5-FU介导的抗肿瘤活性的重要作用机制[21]。体内异种移植实验表明，新型pan-caspase抑制剂IDN-7314与5-FU联合应用可协同阻断肿瘤生长,TNF-α分泌水平的升高和坏死途径成分的表达，可能有助于预测促程序性坏死治疗的敏感性。pan-caspase抑制剂促进5-FU诱导的细胞程序性坏死，这种作用是通过TNF-α的自分泌介导的。因此研究人员认为pan-caspase抑制剂可作为结肠癌辅助化疗的新途径[22]。

近年来，TNF信号通路在结肠癌细胞中不同DNA损伤剂的细胞毒性作用得到研究。在异种移植瘤模型中，RIP1的下调导致结肠癌细胞对7-乙基-10-羟基喜树碱(SN38)的抗性增强。在单用SN38或联合TNF治疗后，RIP1和RIP3水平的明显下降[23]。

并且有进一步研究发现，TNF-α与TNFR1的结合可激活多种信号通路，主要促进NF-κB的激活，但也可导致细胞死亡。一氧化氮供体三硝酸甘油酯(GTN)将免疫细胞或化疗诱导的癌细胞产生的TNF-α，转化为结肠癌细胞中的一种促死亡介质。GTN介导的cIAP1对第571位和第574位半胱氨酸的S-亚硝基化，抑制了其E3泛素连接酶活性，进而降低了第63位赖氨酸连接的RIP1泛素化，并启动了死亡复合物的组装。该研究表明，一氧化氮供体与化疗药物诱导的TNF-α联合应用是一种潜在的有价值的抗癌策略[24]。

此外，有研究通过在2-甲氧基-6-乙酰基-7-甲基胡桃酮(MAM)处理的HCT116和HT29结肠癌细胞中形成RIP1/RIP3复合物，发现RIP1/RIP3复合物触发的细胞内钙积累是MAM诱导的持续JNK活化和线粒体ROS生成的重要介质[25]。

3.RIP1与胰腺癌 紫草素(SK)可以通过调节RIP1和RIP3的表达，从而诱导胰腺癌细胞的凋亡，最终抑制人胰腺癌细胞的增殖。此外，SK还能增强吉西他滨的体内外抗肿瘤作用[26]。

细胞凋亡逃避是胰腺癌耐药的关键机制之一，也是胰腺癌预后不良的原因之一。半胱天冬酶第二次线粒体衍生激活剂(SMAC)模拟物BV6，可以刺激胰腺癌细胞产生TNF-α和形成的坏死因子复合物(RIP1/RIP3)，从而促进肿瘤细胞的凋亡。MLKL的药物抑制剂则能显著降低BV6/IFN-γ(γ干扰素)诱导的细胞程序性坏死[27-28]。

有研究表明，90%的胰腺癌为导管腺癌，坏死小体的主要组成蛋白RIP1和RIP3在胰腺导管腺癌中高表达，并能被化疗药物吉西他滨进一步上调，从而促进体内癌细胞的发展。然而体外阻断坏死小体可促进癌细胞增殖，并诱导肿瘤细胞具有侵袭性的致癌表型。相反，体内RIP3的耗竭或RIP1的抑制对小鼠的癌症发展具有抑制作用，该作用与高免疫原性髓系和T细胞浸润有关。同样，与RIP1/RIP3复合物形成坏死小体的Fas相关死亡域蛋白(FADD)、程序性死亡的下游介质MLKL、细胞凋亡的主要驱动因子Caspase-8，在胰腺导管腺癌中都被上调[29]。

4.RIP1-Tag2小鼠模型与肿瘤 RIP1-Tag2转基因小鼠是一种胰腺β细胞肿瘤模型。RIP1-Tag2小鼠构建是将鼠胰岛素Ⅱ启动子与编码T和t抗原的猴空泡病毒40(SV40)早期区域融合，构建转基因所需的RIP1-Tag2线性片段，其中包含胰岛素基因的转录增强子和多聚腺苷酸终止子。此鼠在肿瘤发生的各个阶段有相应变化明显的组织病理学特点。大量实验数据支持RIP1-TAG2小鼠模型作为人类同源肿瘤的代表，该模型在胰腺神经内分泌肿瘤研究方面拥有极大前景，并且给未来的个性化肿瘤治疗提供了新的靶点[30]。

在RIP1-Tag2小鼠的肿瘤转移研究中发现，小鼠肺和脾脏均存在胰岛素微转移，T抗原和胰岛素抗体在原发性β细胞肿瘤晚期表达均下降，提示至少部分微转移来自于β细胞肿瘤的早期或晚期，然后恢复到未分化状态，如肿瘤干细胞[31]。

此外，1HNMR(核磁共振的谱系)代谢组学技术被应用于鉴定潜在的标志物，以监控RIP1-Tag2小鼠胰岛β细胞瘤的进展。研究发现在RIP1-Tag2小鼠体内，代谢表型与SV40大T抗原的植入有关[32]。

还有研究利用RIP1-Tag2小鼠在体外和转基因小鼠胰腺神经内分泌肿瘤(PNENs)模型，发现依那普利和阿斯(ASS)对肿瘤生长有明显抑制作用，为PNENs的化学预防和治疗提供一种途径[33]。

四、展望

RIP1通过泛素化、激活Caspase-8依赖的程序性坏死途径以及协同其他因素促使坏死小体的生成，抵抗细胞凋亡，拮抗化疗药物，从而维持肿瘤细胞的存活。然而，RIP1介导的程序性坏死和泛素化在肿瘤和炎症的发生发展过程中作用的研究大多集中在离体细胞实验中。RIP1在消化系统肿瘤的作用机制仍有待体内实验进一步阐明，以期为开发靶向治疗药物用于肿瘤的辅助治疗提供新的途径。