胆石症患者血清微小RNA-122、高迁移率族蛋白1和角蛋白-18水平及其临床意义*

程铁军，张明智

血清学指标对胆石症也具有一定的判断价值，miR-122、高迁移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB 1）和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶裂解角蛋白-18（cysteine aspartate protease cleavage keratinocyte-18，CCK-18）曾作为急性肝损伤的标志物，因为miR-122仅表达于肝细胞，通过调节胆固醇和脂肪酸代谢，参与胆结石的发生和发展[1-4]，而HMGB 1和CCK-18是由免疫细胞和坏死细胞释放的具有促炎活性的核结合蛋白，两者均为肝上皮细胞的标志物[5]。动物实验表明[6]，胆管结扎后动物血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平升高。本研究检测了胆石症患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平变化，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2015年1月～2018年2月我院收治的胆石症患者201例，男性69例，女性132例；平均年龄为（49.6±6.1）岁。所有胆石症患者均经超声和CT检查诊断，其中胆色素型胆管结石68例（33.8%）、胆固醇型胆管结石71例（35.3%）、混合型胆管结石61例（30.8%）。BMI为（23.9±3.9）kg/m2。根据疾病严重程度，将患者分为单纯性胆石症组（n=97）和复杂性胆石症组（n=104）。复杂性胆石症诊断标准[7]为：（1）胆囊纤维化严重或Calot三角粘连、瘢痕化、脂肪堆积、分离难度大；（2）胆囊前三角区与后三角区之间界限不清；（3）胆囊严重炎性水肿或萎缩。符合其中1项者，则诊断为复杂性胆石症。纳入标准为：（1）胆囊结石诊断明确，伴或不伴继发性胆总管结石；（2）无梗阻性黄疸表现。排除标准：（1）伴有急性胆道感染；（2）合并胆道肿瘤；（3）伴有严重的胆源性胰腺炎；（4）入组前曾接受过外科治疗患者。选择同期健康体检者103例作为对照，男性45例，女性58例；平均年龄为（50.5±5.8）岁，BMI为（23.5±3.5）kg/m2。两组人群性别、年龄和BMI比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。所有患者签署知情同意书，本研究获得我院医学伦理委员会批准。

1.2 观察指标 采用RT-PCR法测定血清miR-122水平；采用ELISA法测定血清HMGB 1和CCK-18水平（试剂盒购自上海创祥生物科技有限公司）。

1.3 统计学分析 应用SPSSS 22.0和Medcalc 16.2软件进行统计学分析。首先进行正态性分布检验，对正态分布的计量资料以（x±s）表示，两组间比较采用t检验。对非正态分布的计量资料以【M（Q1，Q3）】表示，组间比较采用Mann-Whitney U秩和检验。计数资料以n（%）表示，采用卡方检验。以患者病情严重程度为因变量，以Child分级、肝硬化、胆结石分期、腹腔积液、血清白蛋白、miR-122、HMGB 1和CCK-18作为自变量，建立Logistic回归模型，构建miR-122、HMGB 1和CCK-18诊断的ROC曲线，计算曲线下面积（AUC）。取约登指数（灵敏度+特异度-1）最大处作为各指标诊断复杂性胆石症的截断点。P＜0.05被定义为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组受试者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平比较 胆石症患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平均显著高于健康人，差异有统计学意义（P＜0.05，表 1）。

表1 两组血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平[M（Q1,Q3），（±s）]比较

表1 两组血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平[M（Q1,Q3），（±s）]比较

胆石症健康人统计值P例数201 103 miR-122 4.7（0.9，14.3）0.9（0.4，3.1）6.107＜0.001 HMGB1（ng/mL）2.5±0.7 2.1±0.4 6.332＜0.001 CCK-18（U/L）126.8±20.5 101.4±18.7 10.845＜0.001

2.2 不同严重程度胆石症患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平比较 97例单纯性胆石症患者血清 miR-122、HMGB 1和 CCK-18水平分别为 3.5（0.7，8.5）、（2.2±0.5） ng/mL 和（112.4±19.4） U/L，显著低于104例复杂性胆石症患者【分别为5.8（0.9，16.2）、（2.8±0.8） ng/mL 和 （140.2±23.5） U/L，Mann-Whitney U=3.107，P=0.016；Mann-Whitney U=6.241，P＜0.001；Mann-Whitney U=9.171，P＜0.001】，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 影响单纯性胆石症进展为复杂性胆石症的单因素分析 单因素分析显示，两组在性别、年龄、BMI、既往手术史和糖尿病方面比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而两组在肝硬化和腹腔积液方面比较，差异有统计学意义（P＜0.05，表 2）。

表2 影响复杂性胆石症发生的单因素[n（%），（±s）]分析

表2 影响复杂性胆石症发生的单因素[n（%），（±s）]分析

单纯性（n=97） 复杂性（n=104） x2/t P性别男32（33.0） 37（35.6） 0.149 0.699女65（67.0） 67（64.4）年龄（岁） 52.4±6.5 51.3±5.2 1.319 0.187 BMI（kg/m2）23.7±4.024.1±4.30.6830.494肝硬化是26（26.8） 69（66.3） 18.418 ＜0.001否71（73.2） 35（33.7）既往手术史有13（13.4） 18（17.3） 0.587 0.444无84（86.6） 86（82.7）糖尿病是20（20.6） 25（24.0） 0.338 0.561否77（79.4） 79（76.0）腹腔积液是24（24.7） 47（45.2） 9.187 0.002否73（75.3） 57（54.8）

2.4 影响单纯性胆石症进展为复杂性胆石症的多因素分析 将单因素分析有统计学意义的因素，如肝硬化、腹腔积液、血清miR-122、HMGB 1和CCK-18作为自变量，将胆石症严重程度作为因变量纳入多因素Logistic回归分析，结果显示，肝硬化、腹腔积液、miR-122、HMGB 1和CCK-18水平为单纯性胆石症进展为复杂性胆石症的危险因素（表3）。

2.5 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平联合检测诊断复杂性胆石症的效能分析 在单指标检测方面，血清CCK-18与miR-122或HMGB 1比，其诊断效能差异无统计学意义（Z=0.839，P=0.401；Z=1.266，P=0.206）；应用血清 miR-122、HMGB 1和CCK-18水平联合检测诊断复杂性胆石症的模型为：F=-7.098+0.309×miR-122+1.297×HMGB 1+0.019×CCK-18，即联合检测诊断复杂性胆石症的AUC显著高于miR-122或HMGB 1单指标检测（Z=2.694，Z=3.419，P=0.007，P=0.001，表4，图 1）。

表3 影响单纯性胆石症进展为复杂性胆石症的多因素分析

图1 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18联合检测诊断复杂性胆石症的ROC曲线比较

表4 血清miR-122、HMGB 1和CCK-18联合检测诊断复杂性胆石症的效能分析

3 讨论

血清学指标在诊断胆结石等疾病中表现出一定的优势，其不受胆结石解剖位置的影响，可以较好地预测胆结石患者的病情，为临床治疗提供依据[8-11]。我们检测了胆石症患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平变化，并探讨了三者与胆石症病情的关系，以期为临床早期判断胆石症患者病情提供参考。

miR-122在肝脏特异性表达，占肝脏miRNA总量的70%，具有调节脂肪酸及胆固醇代谢的功能[12]。HMGB 1和CCK-18均为机体内促炎性蛋白，为肝细胞炎性标志物。动物实验[13]表明，当胆囊受到损伤时，血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平呈现升高的趋势。本研究结果显示，胆石症患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平显著高于健康人，提示其可作为判别胆结石患者病情的潜在生物学指标。本研究结果显示，复杂性胆石症患者血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平显著高于单纯性胆石症患者，更提示其与患者病情的关系。为进一步分析影响单纯性胆石症进展为复杂性胆石症的相关危险因素，本研究采用单因素和多因素Logistic回归分析，结果显示存在肝硬化、有腹腔积液、血清miR-122、HMGB 1和CCK-18水平升高为复杂性胆石症的危险因素。在肝硬化时，患者肝功能受损，影响了胃肠激素的灭活，促进了胆结石的发生发展[14-16]。在肝功能受损后，腹腔积液增多且白蛋白水平降低，腹腔积液的长期存在和低蛋白血症易导致胆囊壁增厚，甚至胆囊纤维化，导致胆囊收缩能力下降，胆汁淤积，形成结石[17，18]。miR-122通过抑制脂肪酸和胆固醇代谢，造成胆囊胆固醇过量积聚，导致结石形成[19]。CCK-18为参与胆囊运动调节的激素，CCK-18水平升高，胰腺消化酶分泌减少，诱发胆囊结石进一步发展[20]。本研究同时分析血清miR-122、HMGB 1和CCK-18诊断复杂性胆石症的效能，结果显示，三者单独检测时，AUC值介于0.7～0.8之间，而采用三者联合检测诊断复杂性胆石症，结果显示可将诊断的AUC提高至0.819，显著高于三者的单独检测，表明联合检测可最大限度地避免对病情的误判。