淘米水发酵物中2种有机酸的测定

杜 刚，陆小凯，刘仙花，洪耀强，杨海英

(1.云南民族大学 民族药资源化学国家民族事务委员会-教育部重点实验室, 云南 昆明 650500； 2.云南民族大学 化学与环境学院，云南 昆明 650500)

稻谷是我国的主要粮食作物之一，也是世界上第二大农作物，我国年产量超过2.0亿吨[1].淘米水即洗米后留下的水，主要含有米糠和糊粉层的营养成分，包括蛋白质、膳食纤维、淀粉、谷维素、维生素和矿物质等多种生物活性成分[2].米糠蛋白具有抗癌活性和保健功能[3]，米糠肽是米糠蛋白经蛋白酶水解得到的低分子量多肽，具有低过敏性、易溶解特点[4-5].Choi等[6]对米糠进行CO2超临界萃取，提取物表现出良好的生发效果，毛囊显著增多.

云南傣族人把每天的淘米水放入盆或桶等容器，进行自然发酵，传统发酵淘米水用于洗发，具有去头屑、润发、亮发和促使头发变黑、变粗等作用[7].淘米水自然发酵过程伴随pH下降，推测是淘米水在发酵过程产生了有机酸.目前测定有机酸的主要分析方法有气相色谱法[8],离子色谱法[9]、离子排斥色谱法[10-11]，毛细管电泳[12]和反相高效液相色谱法[13-15].为研究淘米水发酵过程有机酸的种类，本文采用高效液相色谱法对淘米水发酵物中的有机酸测定,以逐步揭示傣族用淘米水对头发起养护作用的物质基础，为传统发酵淘米水在日化工业的开发提供实验依据.淘米水发酵液中有机酸的HPLC分析方法目前尚无报道.

1 实验部分

1.1 实验材料及试剂

淘米水为云南省西双版纳傣族自治州勐腊县曼那村传统发酵2 d的淘米水，傣族香米云南省勐海县傣乡米厂.

甲醇为色谱纯，Fisher公司；哇哈哈纯净水；乙酸、乳酸(纯度>99%)；NaH2PO4(AR)、磷酸(AR)等购自国药集团化学试剂有限公司.

1.2 实验仪器

Agilent 1200高效液相色谱仪，包括DAD紫外检测器，Agilent色谱工作站(美国安捷伦公司)；LE204E电子天平(瑞士梅特勒托利多)；BINDER VD53真空干燥箱(德国宾得)；H2-16KR台式离心机(湖南可成).

1.3 实验方法

1.3.1 样品溶液的制备

取20 mL淘米水发酵液，进行12 000 r/min离心10 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，4 ℃的冰箱冷藏备用.

1.3.2 标准品的配制

取经40 ℃减压干燥至恒重的乙酸、乳酸对照品适量，精密称定，置于100 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，过0.45 μm微孔滤膜后置于4 ℃的冰箱中保存.配制的对照品混合标准溶液每毫升含4.950 mg乳酸、3.144 mg乙酸，乳酸单标溶液质量浓度为 17.09 mg/mL，乙酸单标溶液质量浓度为 2.005 mg/mL.

1.3.3 流动相的考察

为了得到良好的分离效果，依次考察了不同物质的量浓度的NaH2PO4磷酸盐缓冲溶液(0.01、0.02、0.03 mol/L)，不同pH值的流动相(2.0、2.3、2.5、2.9、3.5、4.0、4.5、5.0)，不同比例甲醇(1%、10%、20%、30%、70%)对色谱分离的影响.从目标化合物分离度、响应值、保留时间、峰形各方面进行比较.

1.3.4 流速的考察

考察流动相不同流速(0.4、0.6、0.8、1 mL/min)对色谱分离的影响.

1.3.5 色谱条件

色谱柱：Agilent Zorbax SB-Aq(4.6 mm×150 mm，5 μm,)，流动相：甲醇-20 mmol/L，pH为2.0的NaH2PO4磷酸盐缓冲溶液(体积比1∶ 99)，流速：0.4 mL/min，柱温：25 ℃，检测波长：210 nm.

1.3.6 标准曲线的绘制

精密吸取4.950 mg/mL乳酸，3.144 mg/mL乙酸的对照品混合溶液1、5、10、20、50 μL，注入HPLC色谱仪，按照“1.3.5”的色谱条件测定，以峰面积(A)为纵坐标，质量浓度(ρ)为横坐标，进行线性回归，得标准曲线方程.

1.3.7 稳定性考察

取样品溶液(1.3.1方法配制)，放置0、2、4、8、16、24 h后，精密吸取样品溶液5 μL注入HPLC色谱仪,按“1.3.5”项下色谱条件测定，得到峰面积A，计算RSD值，考察样品的稳定性.

1.3.8 精密度考察

在 “1.3.5”色谱条件下，精密吸取含4.950 mg/mL乳酸、3.144 mg/mL乙酸的对照品混合溶液5 μL, 注入HPLC色谱仪，连续进样3次，测定得峰面积A，计算RSD值.

1.3.9 回收率试验

精密量取已知含量的淘米水发酵液样品5份，每份2 mL，分别加入17.09 mg/mL乳酸标准溶液0.5，0.8，1，1.2，1.5 mL，2.005 mg/mL乙酸标准溶液0.5，0.8，1，1.2，1.5 mL，按照“1.3.1”项下处理样品，按“1.3.5”色谱检测条件进行测定，计算乳酸、乙酸平均回收率.

1.3.10 样品测定

按“1.3.5”项下色谱条件，精密吸取样品溶液5 μL，采用外标法对淘米水发酵液样品中的有机酸含量进行计算.

2 结果与分析

2.1 流动相的选择

在“1.3.3”项下方法，经过试验对比筛选，当NaH2PO4缓冲盐浓度为0.02 mol/L，甲醇-NaH2PO4缓冲盐体积比例为1∶ 99，流动相pH为2.0时，样品溶液得到最佳分离效果.

2.2 流速的选择

按“1.3.4”项下方法实验，发现流速在0.4 mL/min时保留时间适当，峰形较好，故选择流动相流速为0.4 mL/min.

2.3 标准曲线的绘制

按“1.3.6”项下方法测定，绘制乳酸标准曲线，见图1，乳酸回归方程为y=570.66x+11.252，R2=1，表明乳酸在0.495～24.75 mg/mL范围内线性关系良好.绘制乙酸标准曲线，见图2，乙酸回归方程为y=1 533.2x-307.72，R2=0.993 2，表明乙酸在0.314 4～15.72 mg/mL范围内线性关系良好.

2.4 稳定性实验

按“1.3.7”项下方法测定峰面积A，计算峰面积的RSD，乳酸峰面积的RSD为0.58%，乙酸峰面积的RSD为2.50%，表明样品放置24 h稳定.

2.5 精密度实验

按“1.3.8”项下方法实验，测得峰面积A，计算峰面积的RSD值，乳酸的RSD为0.53%，乙酸的RSD为0.46%，表明HPLC仪器的精密度良好.

2.6 回收率试验

按“1.3.9”项下方法实验，分别计算乳酸、乙酸回收率，乳酸平均回收率为95.12%，RSD为2.17%(n=5)；乙酸平均回收率为92.9%，RSD为4.25%(n=5).

2.7 淘米水发酵液中有机酸的分析

按“1.3.10”项下方法，对样品溶液和标准品溶液进行检测，确定样品溶液中含有乳酸①和乙酸②2种有机酸，对照品和样品溶液的HPLC色谱图如图3、图4所示.淘米水发酵液中乳酸①含量为8.575 mg/mL，乙酸②含量为1.040 mg/mL.

3 结语

本实验建立淘米水发酵样品中有机酸含量测定的方法，适用于淘米水发酵液中有机酸的测定.样品经离心、过滤，检测条件为：色谱柱Agilent Zorbax SB-Aq(5 μm，4.6 mm×150 mm)；紫外检测波长210 nm；流动相(V/V)为1%甲醇-99%的20 mmol/L NaH2PO4溶液(pH 2.0)；流速0.4 mL/min；柱温25 ℃.