欧文氏弧菌毒力蛋白PirAB的原核表达与纯化

张萌萌 ， 潘迎捷,2， 王永杰,2*

(1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306;2.农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，上海 201306)

对虾急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease, AHPND)，又称早期死亡综合征(EMS)，于2009年首次在中国海南爆发[1]。随后，越南、马来西亚和泰国相继爆发了该疾病，之后又蔓延到菲律宾和墨西哥沿海地区[2-4]。2016年南美部分国家和地区爆发了AHPND[5-8]。报道称该疾病能迅速导致养殖塘中70%的对虾幼虾死亡，造成对虾养殖行业减产约23%[5]。研究发现AHPND的主要致病菌为一种副溶血弧菌，主要感染斑节对虾、凡纳滨对虾以及中国对虾的幼虾。进一步研究表明，该致病性副溶血性弧菌(Vibroparahaemolyticus)携带的特殊大质粒上的pirAB基因能够引发AHPND[9]，而普通的V.parahaemolyticus不能引起该疾病。Lee等[9]将pirAB基因敲除后发现其毒力急剧下降且并未引起AHPND症状[10]。研究证实毒力基因pirAB为AHPND的关键致病因子。本课题组从上海地区凡纳滨对虾中分离出并通过活体实验证明为1株AHPND致病弧菌，并鉴定为Vibrioowensii[11-14]。为了进一步探索该菌株的致病性与毒力蛋白的相关性，本研究通过PCR扩增获得该欧文氏弧菌的毒力基因pirA和pirB，分别克隆并连接到合适的原核表达载体上，经大肠埃希菌原核表达和亲和层析纯化获得大量PirAV.o和PirBV.o毒力蛋白，并对其进行冷冻干燥保存，为进一步蛋白功能研究和抗体合成提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和质粒 AHPND致病性VbrioowensiiSH-14、表达质粒pET-21和pGEX-4t-1本实验室保存；克隆菌株EscherichiacoliTop10、表达菌株EscherichiacoliBL21感受态细胞购自天根生化(北京)科技有限公司。

1.1.2 培养基 LB固体培养基、LB液体培养基、TSB培养基、TSA培养基购自北京陆桥技术有限公司。

1.1.3 试剂及仪器 DNA分子标尺、上样缓冲液、2×TaqPCR MasterMix、细菌基因组DNA提取试剂盒、DNA纯化回收试剂盒购自天根生化(北京)科技有限公司；超滤管、Whatman硝酸纤维膜、密理博0.22、0.45 μm滤膜、滤器购自上海麦约尔生物公司；非预染蛋白质分子标尺、兔源GST一抗、碱性磷酸酶标记的抗兔二抗、鼠源His一抗和碱性磷酸酶标记的抗鼠二抗购自上海英基生物科技有限公司；预染蛋白质分子标尺、限制性内切酶BamH I、Sal I和Xhol I、T4连接酶购自Takara公司。过硫酸铵、TEMED、甘油、Tween-20、30%聚丙烯酰胺、苯甲基磺酰(PMSF)、BCIP/NBT显色液、氯化钠、氯化钾、十二烷基硫酸钠、脱脂奶粉购自生工生物工程(上海)股份有限公司；咪唑、还原性谷胱甘肽、甲醇、冰乙酸、甘氨酸购自上海国药集团；考马斯亮蓝R-250购自赛默飞公司。亲和层析柱GSTrap FF 5 mL和His Trap 5 mL柱子、蛋白电泳槽(SE250)、湿转仪(EPS2A201)、AKTA pure 蛋白纯化仪均购自美国通用电器公司(GE)；恒温培养箱(H-200B,上海世平)；小型高速冷冻离心机、高速冷冻离心机、PCR仪、移液枪均购自德国艾本德公司(Eppendorf)；81-2型恒温磁力搅拌器(上海司乐仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培养 取-80 ℃甘油保存的VbrioowensiiSH-14菌种在TSA(1.5% NaCl)培养基上涂布过夜培养。挑取阳性菌落，接种到TSB(1.5% NaCl)液体培养基中，30 ℃、200 r/min培养12 h，6 000 g离心菌体待用。

1.2.2 基因克隆 首先将VbrioowennciiSH-14 菌体沉淀重悬并用基因组提取试剂盒获取其DNA。根据已发表质粒pVHvo序列设计扩增毒力基因pirAV.o和pirBV.o全长序列的引物(表2)并进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)。扩增pirAV.o的引物为PirAV.o-F/PirAV.o-R，PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后进行终延伸72 ℃ 10 min。扩增pirBV.o的引物为PirBV.o-F/PirBV.o-R，PCR反应程序与扩增pirAV.o相同。PCR扩增产物经DNA纯化试剂盒纯化后，目的片段pirAV.o和pirBV.o分别于16 ℃过夜连接到T克隆载体上，并将连接后载体转化感受态细胞Top10，涂板通过蓝白斑筛选和PCR验证，获取阳性克隆。挑取阳性克隆液体培养，提取质粒并进行测序，经序列比对后确定为pirAV.o和pirBV.o。

1.2.3 表达质粒构建 对于PirAV.o，针对对应序列设计带有限制性内切酶位点的引物PirAV.o-1F-Ndel I:和PirAV.o-333R-Xhol I，经PCR反应获取两端携带酶切位点的基因片段。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环。反应产物纯化回收后，再用Ndel I 和Xhol I 限制性内切酶进行双酶切，获得与pET-21b相同黏性末端的片段，然后两者于16 ℃过夜连接，得到连接成功的表达质粒pET-21b-PirAV.o。PirBV.o质粒的构建除了引物为PirBV.o-1F-BamHI和PirBV.o-1317R-XholI外，其余步骤与PirAV.o质粒相同，得到连接成功的表达质粒pGEX-4T-PirBV.o。将构建成功的重组质粒分别转化表达菌株大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞中，LB固体培养基平板上37 ℃涂布培养16 h，根据菌落PCR筛选确定阳性菌落。挑取阳性菌落置于LB(Amp+)液体培养基中，37 ℃、200 r/min过夜培养后，部分重组表达菌株用已灭菌的80%甘油于-80 ℃冰箱中保存待用。其余培养菌液进行重组质粒的提取，并再次对所构建重组质粒的插入片段进行测序和序列比对分析，确保构建过程中序列无点突变，准确无误。采用在线软件ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)预测毒力蛋白PirAV.o和PirBV.o的理论分子量大小，作为表达验证的参考依据。

1.2.4 融合蛋白表达与电泳分析 取出-80 ℃保藏的含有重组质粒的BL21表达菌株，按照1∶100的比例接种至LB(Amp+)液体培养基中，37 ℃、200 r/min培养3～4 h后，测定OD600值至0.5～0.7之间，加入0.1 mol/L IPTG，22 ℃、200 r/min，诱导培养16 h。4 ℃条件下8 000 r/min高速离心10 min，并收集表达菌体待用。将收集到的菌体重悬于含5%甘油的PBS(pH 7.3)，加入蛋白酶抑制剂PMSF，置于-20 ℃冰箱中冷冻1.5 h后取出，室温融化，加入溶菌酶于37 ℃、200 r/min的摇床中孵育30 min。取出后进行超声破碎细胞。冰上超声，超4 s停6 s，100次。4 ℃、12 000 r/min 离心30 min，收集上清，去除沉淀，将上清置于4 ℃储存待用。配置10% SDS-PAGE电泳凝胶对表达蛋白量和蛋白大小进行分析。然后分别通过His标签融合蛋白和GST标签融合蛋白特异性抗体免疫印迹法定性验证蛋白His-tag-PirAV.o和GST-tag-PirBV.o融合蛋白表达。

表1 10% SDS-PAGE凝胶组分

注：“-”代表此项不适用

1.2.5 融合蛋白纯化 大量获取表达蛋白细胞破碎上清，经亲和层析柱特异性优势结合标签蛋白，获取目的蛋白。所有缓冲溶液均需0.45 μm滤膜过滤，并超声30 min进行脱气处理，避免对层析柱和纯化仪器泵体造成损害。对于His-tag-PirAV.o蛋白纯化：清洗AKTA-start纯化系统，装上Histrap层析柱，用20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液平衡柱子将细胞破碎上清样品泵入纯化系统中。选取20～500 mmol/L咪唑梯度洗脱，收集洗脱产物。对于GST-tag-PirBV.o融合蛋白纯化：清洗纯化系统，装上GSTtrap层析柱后用PBS缓冲溶液平衡，将样品泵入，选取还原性谷胱甘肽洗脱，收集洗脱蛋白，利用SDS-PAGE电泳验证纯化效果。

2 结果与分析

2.1 表达菌株的构建

表2列出扩增pirAV.o和pirBV.o引物，pirAV.o目的片段长度为333 bp,pirBV.o目的片段长度为1 317 bp。图1(a、d)所示，pirAV.o和pirBV.o在PCR扩增片段，在琼脂糖凝胶上分别获得对应大小的单一条带。空载质粒提取后同样用1%琼脂凝胶确定质粒大小，pET-21b(b)和pGEX-4T-1(e)空载全长分别为5 369 bp和4 969 bp,如图1(b)所示。将双酶切后的目的片段和质粒载体用连接试剂盒连接后，获取重组质粒pET-21b-PirAV.o和pGEX-4T-1-PirBV.o,如图1(c、f)所示，条带大小与预测一致,经测序结果分析，重组质粒上成功插入的pirAV.o和pirBV.o序列没有发生突变。

图1 重组表达质粒pET-21b-PirAV.o和pGEX-4T-1-PirBV.o的构建Fig.1 Construction of the recombination expression plasmid of pET-21b-PirAV.o and pGEX-4T-1-PirBV.o

引物名称引物序列PirAV.o-F5′-ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT GAA AC-3′PirAV.o-R5′-ATG AGT AAC AAT ATA AAA CAT GAA AC-3′PirBV.o-F5′-ATG ACT AAC GAA TAC GTT GTA AC-3′PirBV.o-R5′-ATG ACT AAC GAA TAC GTT GTA AC-3′PirAV.o-1F-Ndel I5′-GCG CAT ATG AGT AAC AAT ATA AAA CATG-3′PirAV.o-333R-Xhol I5′-GCG CTC GAG GTG GTA ATA GAT TGT ACAG-3′PirBV.o-1F-Bam HI5′-ACG GCG AGG GAT CC A TGA CTA ACG AAT ACG TTG TAAC-3′PirBV.o-1317R-Xho I5′-ACG GCG AGC TCG AG C TAC TTT TCT GTA CCA AAT TCA TCG-3′

注：下划线表示未酶切位点

2.2 蛋白在大肠埃希菌中表达分析和免疫印迹法验证

SDS-PAGE电泳分析细菌裂解液(图2)证实，蛋白PirAV.o和PirBV.o在大肠埃希菌BL21(DE3)细胞中成功表达。图2(a、c)显示，IPTG处理6 h后诱导组表达蛋白量比未诱导组要高很多；细菌裂解液的上清液和沉淀物蛋白中都能观察到具有预期分子量大小的蛋白条带。目的条带粗细表明，50%左右蛋白为可溶性表达，说明22 ℃、0.1 mmol/L IPTG诱导条件下可以成功表达目的蛋白。

通过His标签融合蛋白和GST标签融合蛋白特异性抗体免疫印迹法，PirAV.o免疫印迹结果显示(图2b)，未诱导组在17 kDa附近没有条带而诱导组存在明显条带，并且与预测蛋白大小一致。说明该条带即为PirAV.o融合蛋白。PirBV.o免疫印迹结果显示(图2d)，诱导组在70 kDa附近显色，与预测蛋白大小一致，说明该条带对应蛋白为PirBV.o融合蛋白。所以免疫印迹法进一步确定了这两种标签蛋白在22 ℃、0.1 mmol/L IPTG诱导条件下均成功表达。

图2 PirAV.o和PirBV.o融合蛋白诱导表达SDS-PAGE和免疫印迹分析Fig.2 SDS-PAGE and Western Blot for PirAV.oand PirBV.o fusion protein expression(a)和(c)中,M：蛋白分子标尺；1：总菌体裂解液(未诱导)；2：总菌体裂解液(1 mmol/L IPTG 诱导 6 h、22 ℃)；3：IPTG诱导的大肠埃希菌的上清液；4：IPTG 诱导的大肠埃希菌的沉淀物。(b)和(d)中，M：蛋白分子标尺；1：未诱导的大肠埃希菌裂解液；2：诱导的大肠埃希菌裂解液(22 ℃，0.1 mmol/L IPTG 诱导6 h)(a)and (c)：M：protein Marker;1: total cell lysis (non-induced); 2:total cell lysis (1 mmol/L IPTG induced, 6 h, 22 ℃); 3: supernatants of IPTG induced cell lysis; 4: precipitates of IPTG induced cell lysis. (b)and (d): M：protein Marker;1: total cell lysis (non-induced); 2: total cell lysis (1 mmol/L IPTG induced for 6 hours at 22 ℃)

2.3 融合蛋白纯化

对平衡缓冲液优化后选用20 mmol/L Tris-HCl缓冲溶液能够在样品挂柱过程中，有效地减少杂蛋白结合,并选取20～500 mmol/L咪唑梯度洗脱，对比纯化前后的SDS-PAGE可以看出(图3a)，蛋白纯化效果佳。在纯化PirBV.o蛋白时，选取其PBS(pH 7.3)缓冲溶液平衡柱子，30 mmol/L还原性谷胱甘肽洗脱，得到高质量的洗脱峰，对比纯化前后的SDS-PAGE可以看出(图3b)，纯度已满足多克隆抗体制备的要求。

图3 PirAV.o和PirBV.o蛋白过柱纯化后电泳分析Fig.3 Purification of PirAV.o and PirBV.o fusion proteinM：蛋白分子标尺；1：纯化前样品蛋白；2：纯化后收集的蛋白M: protein Marker; 1: proteins before purification; 2: fusion proteins after purification

3 讨 论

AHPND自爆发以来已导致对虾养殖产量骤减，目前对其致病机理的研究还不够深入，尚未找到有效的防控措施。在工作中，我们试图从致病因子的角度进一步认识AHPND。AHPND主要致病因子为毒力蛋白PirAB，大量获取该蛋白的方式主要有两种：硫酸铵沉淀法[10]和异源表达。硫酸铵沉淀法从致病菌沉淀蛋白，但是由于在菌体中表达量少，杂蛋白多，后期纯化复杂等因素，此方法不利于进行后期的攻毒实验。相比之下，借助原核表达系统，可以目标明确地获得大量的融合蛋白，再通过亲和层析纯化，可有效降低杂蛋白含量，集中洗脱高浓度蛋白。

本研究成功构建了pirAB的原核表达体系。在摸索诱导大肠埃希菌表达融合蛋白的最佳条件时，优化了不同IPTG诱导浓度(0.1、0.5、1.0 mmol/L)和不同温度(16、22、30 ℃)等因素对蛋白诱导表达量的影响。通过SDS-PAGE凝胶分析发现，不同浓度IPTG对蛋白表达量影响不大，高温条件使大量蛋白以包涵体形式存在于沉淀中。为了便于后期纯化，使超声后的蛋白以分泌形式存在于细胞破碎液，在表达后期选用在22 ℃、0.1 mmol/L IPTG条件下诱导，在上清中获得了大量可溶性表达蛋白。

蛋白纯化过程中，不同缓冲溶液有很大差异。本研究通过尝试不同的缓冲溶液来优化纯化体系。研究中还发现存放于4 ℃冰箱的纯化蛋白一周后出现降解。蛋白的降解，会对后期的研究工作造成很大的影响，使前期的工作功亏一篑。为避免蛋白在4 ℃降解，首先尝试在超声破碎时添加丝氨酸酶抑制剂(PMSF)。但是由于PMSF有效时间短，仍无法避免蛋白在存放过程中的降解，所以在后期的尝试中采用先浓缩再真空冷冻干燥相结合的方法有效避免了蛋白降解的问题，保存了大量冷冻干燥的蛋白样品，为下一步的多克隆抗体制备提供充足的合格的抗原，也为后期凡纳滨对虾活体蛋白攻毒实验做准备。