核酸适配体在微流控芯片中筛选及病毒性疾病中应用

向梦琦， 洪少力， 董浩宇， 庞代文， 张志凌*

(1.武汉大学化学与分子科学学院，生物医学分析化学教育部重点实验室，湖北武汉430072； 2.武汉纺织大学电子与电气工程学院，湖北武汉 430200)

1 前言

核酸适配体是能形成特定三级结构的寡核苷酸序列，其具有体积小、结构灵活、无毒性、稳定性高、易化学修饰与功能化的特点。可进行大量低成本合成[1]，特定的三级结构是其特异性结合的原因[2]。其亲和力与抗体相比，解离常数Kd值大多数在nmol到pmol范围内。核酸适配体的靶标小到无机离子[3]、有机分子[4]，大到蛋白质[5]、酶[6]、受体[7]、病毒[8]以及整个细胞[9]等，其在生物传感[10]、影像探针[11]、靶向诊断与治疗[12]等生物医学基础研究和疾病诊断领域得到广泛应用。筛选针对靶标特异性核酸适配体的过程通常可分为五个重复步骤：结合、分离、洗脱、扩增和克隆测序。筛选后的核酸适配体可化学合成与高度纯化，减少了抗体存在批次间差异的问题。自1990年Gold等[6]首次提出指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)以来，已引起研究者广泛兴趣，并有较多关于核酸适配体的筛选及其应用的报道。本文重点介绍核酸适配体在微流控芯片领域进行筛选的研究进展，以及阐述其在病毒性疾病的应用以及展望。

2 微流控SELEX

传统SELEX筛选轮次多(一般10～20轮)，需要专业人员操作，是劳动密集型和时间成本型的过程。微流控技术的迅速发展，提高了核酸适配体的筛选效率，从而加速了核酸适配体的发现，因而将微流控技术和SELEX相结合是研究热点之一。首先，芯片体积小，在处理少量试剂时，增加筛选的严苛性。并能降低试剂与样品的用量，进而降低筛选成本。其次，在芯片流体通道中，可控制流体流动方式，能较好除去弱结合或未结合的非特异性核酸，大大缩小库的容量。然后，微流控芯片能够增大表面积与体积比，进一步增大表面张力，显著提高分离效率，有效减少筛选轮次，节约整个筛选时间。再者，芯片更加集成化、自动化，相比于传统SELEX是另一大优势。Hybarger等[13]在2005年提出了“一个微流控-SELEX原型”，首次将微流控芯片与SELEX相结合，自此微流控SELEX分离技术不断发展[14 - 18]。

2.1 基于微珠/磁珠的微流控SELEX

基于微珠/磁珠的微流控SELEX是将靶标分子以共价或非共价方式固定在磁性或非磁性微球表面上。将其通入微流控芯片，形成分离富集区域。然后在微通道中通入液相寡核苷酸文库，特异性核酸会与靶标结合。在流体流动情况下，非特异性核酸和弱结合核酸分子被除去。与固定在磁性或非磁性微球表面的靶标特异性结合的核酸分子被洗脱分离后，进行PCR扩展。单链化，纯化形成新的次级文库，多轮筛选后进行克隆测序或高通量测序，分析序列信息。为了更加快速、高效和自动化筛选出核酸适配体，Soh等[19]在2009年发展了一种基于磁珠的微流控SELEX。在微观尺度上，利用独特的物理现象，实现了优越的筛选效率。仅需一轮筛选，可筛选出针对A型肉毒杆菌神经毒素(BoNT/A-rLc)特异性结合的核酸适配体，Kd范围为34～86 nm。同一年，Soh等[20]提出了一个可替代上述分离方法的方法。其采用微磁分离(MMS)芯片，可较好除去未结合的ssDNA，仅需3轮，可筛选出针对链霉亲和素具有高亲和力的特异性核酸适配体，其磁珠回收率高达99.5%，解离常数范围为25～65 nmol/L。

Hong等[16]在磁控微流控芯片上构建了一个快速、高效、集成的筛选平台。精确操控磁珠，在流体流动的状态下，将核酸库与偶联在磁球表面的靶标孵育，有效减少弱结合核酸。并通过原位监测和实时评估控制整个筛选过程。再结合连续流冲洗，进一步除去弱结合和未结合的核酸。仅需两轮，即可筛选出针对肿瘤标志物MUC1蛋白的核酸适配体。此核酸适配体能特异性标记癌细胞，并能进行肿瘤成像，亦可捕获外泌体，捕获效率为64%。Hong等[18]优化了此筛选平台，仅需3轮筛选出针对埃博拉病毒(EBOV)的核酸适配体，并成功应用于EBOV的检测。Lee等[21 - 26]在磁控微流控芯片上，发展了一种新型自动化筛选平台，将整个筛选流程集成到一个芯片上。首先将随机ssDNA文库通入芯片，进行孵育，特异性核酸与修饰有靶标的磁球结合，弱结合和未结合核酸被除去。特异性核酸在芯片中进行PCR扩增。此集成微流控芯片可连续且自动地进行多轮SELEX，以筛选针对靶标特异性适配体。此芯片大大减少了孵育和分离时间，大大缩短整个筛选周期。

2.2 毛细管电泳SELEX

Mendonsa and Bowser等[27]提出了基于CE(Capillary Electrophoresis)的核酸适配体筛选程序，即CE-SELEX[28 - 29]。基于CE-SELEX，目前已有核酸适配体相关的应用。已发展了诸如平衡混合物的平衡毛细管电泳(ECEEM)[30]、平衡混合物的非平衡毛细管电泳(NECEEM)[30 - 31]、Non-SELEX[32 - 34]、微流控自由流电泳(μFFE)[35 - 36]等多种筛选模式。而基于微流控芯片的CE-SELEX：首先，随机ssDNA库与特异性靶标孵育，将此混合物注入微流控芯片中。通入高压直流电场，溶液中未结合的游离核酸、与靶标特异性结合的核酸、与靶标弱结合的核酸根据迁移能力不同进行电泳分离。与传统SELEX相比，基于微流控芯片的CE-SELEX大大节省了实验时间，大大缩短了实验周期，将筛选轮数减少到1～4轮，从而较大提高SELEX的筛选效率。虽然毛细管电泳装置进样体积小，一定程度节约了样品和试剂，但是由于随机文库中有效的目标核酸序列较少，可能存在目标序列缺失的情况，筛选重现性存在差异[37]。而μFFE为CE-SELEX存在的问题，提供了有效的解决办法。与许多分离方式不同，μFFE可连续引入、分离和收集样品[38 - 42]。Bowser等[36]使用μFFE装置筛选出对人免疫球蛋白E(IgE)的特异性DNA适配体。此装置在30 min内可注入1.8×1014个序列，与CE-SELEX相比，文库增大了300倍，一轮选择后，解离常数可达nmol/L范围。μFFE-SELEX无需固定靶标、延长孵育时间或阴性选择，简化了筛选流程。亦可把孵育、分离、富集、PCR扩增等集成在一个微流控芯片上，更加集成化，自动化。

2.3 溶胶-凝胶微流控SELEX

溶胶-凝胶微流控SELEX是在微流体芯片中，利用纳米多孔溶胶-凝胶液滴微粒来固定抗体、调节蛋白、膜受体、甚至全细胞等靶标[43 - 45]，增强靶标热稳定性、化学稳定性[45]。随机文库与不同靶标竞争性结合，以微加热方式洗脱核酸，多轮筛选出针对靶标高亲和力和高特异性的核酸适配体。Kim等[46]发展了一种溶胶-凝胶蛋白微阵列，此三维双纳米多孔溶胶-凝胶基质中可容纳大量活性蛋白质[47]。并首次将溶胶-凝胶蛋白质阵列用在微流控芯片中，筛选针对多个靶标分子的RNA适配体。此过程可扩展到更大的溶胶-凝胶蛋白阵列，开发更高通量和更高效的SELEX。Bae等[48]利用沉积在多孔硅芯片上的溶胶-凝胶液滴，捕获嘌呤代谢物黄嘌呤。靶标不需化学修饰，并用于小分子筛选，仅需7轮筛选可得黄嘌呤的核酸适配体。Ahn等[49]在由5个小室和通道组成的微流控芯片中，用溶胶-凝胶液滴在每个小室内固定酵母TATA结合蛋白及其同源蛋白质，进行核酸适配体的筛选。当RNA随机文库通入芯片时，特异性RNA与靶标结合进入溶胶-凝胶液滴内，严格洗脱后，分离与靶标结合的核酸，极大地提高了RNA适配体对TATA结合蛋白的筛选效率，筛选周期减少了约80%。Ahn等[50]等又优化了溶胶-凝胶复合物的配方，此配方首次用于封装不溶性小分子双酚A。首先在多孔硅基底上形成微阵列，核酸适配体与双酚A产生特异性相互作用，再加热释放结合的核酸适配体进行筛选。溶胶-凝胶不需任何修饰，可固定靶标，结合微流控芯片快速分离，可有效提高筛选效率，减少筛选轮数。

2.4 微阵列SELEX

微阵列可用于SELEX筛选，即微阵列SELEX(Microarray SELEX)。它的优势在于可同时筛选多个靶标，提高了筛选通量，缩短了筛选周期[51]。Collett等[52 - 55]筛选了溶菌酶和和蓖麻毒素的RNA适配体。还将IgE和凝血酶的DNA适配体进行生物素化，并点样到链霉亲和素蛋白修饰的微阵列载玻片上，证明核酸适配体对荧光标记的靶标有高特异性和高亲和力。Chao等[55]发展了一种基于微阵列的多种适配体筛选平台(AD-MAP)。可识别靶蛋白上不同位点的亲和试剂，大大提高分子检测的灵敏度和特异性，实现了“双齿”靶标的试剂识别。Chen等[56]发展了一种基于微流控的SELMA装置，可平行地对16种蛋白质进行高通量测定。Liu等[57]基于微流控芯片和蛋白质微阵列发展了一种有效且快速的SELEX方法。乳铁蛋白用作靶蛋白，而牛血清白蛋白(BSA)，α-乳清蛋白，β-乳球蛋白和酪蛋白作阴性蛋白，将它们分别点样并固定，以制备蛋白质微阵列，并将得到的微阵列进一步整合，用于SELEX(PMM-SELEX)过程的微流体芯片中，7轮筛选获得5种具有高特异性和亲和力的适配体(Lac-14，Lac-6a，Lac-9，Lac-3a)。

3 核酸适配体在病毒性疾病的应用

核酸适配体作为“化学抗体”，有着免疫原性和毒性低的优势，可参与病毒蛋白的吸附、入侵、复制、装配和释放整个感染周期[58]，在病毒性疾病诊断和治疗中具有较大应用潜能。目前，针对人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒(Influenza)、丙型肝炎病毒(HCV)等相关核酸适配体已有相关报道，其他病毒如登革热病毒(DENV)、埃博拉病毒(EBOV)、人乳头瘤病毒(HPV)、SARS病毒、狂犬病毒(RABV)等也有研究，但是病毒适配体库依旧很小，需要不断开发新的病毒适配体。

3.1 流感病毒

甲型流感病毒普遍易感、且呈季节性，致病性高、死亡率高。并由其抗原变异性，自1889年以来曾多次引起世界性大流行。甲型流感病毒根据血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的种类分为不同亚型，血凝素由于抗原性是抗体重要的结合位点，也是研究者广泛研究对象。但是目前针对各亚型的适配体太少，并且缺乏一种能识别一种或多种亚型的适配体。寻找核酸适配体快速诊断流感病毒，并能抑制流感病毒感染具有重要意义。Jeon等[59]筛选出针对H3N2的DNA适配体，并能抑制病毒血凝素和病毒体外感染的能力。Kwon等[60]筛选出的RNA适配体通过中和流感病毒HA的受体结合位点，来抑制病毒与宿主细胞的附着，从而抑制病毒感染。因此可将适配体开发为抗流感病毒的试剂用于疾病诊断与治疗。Nguyen等[61]筛选的适配体IF10和IF22可同时结合H5N1全病毒，并且结合位点不同。同时构建了用于检测H5Nx全病毒的夹心型SPR生物传感器，可快速、准确地检测来自H5N1感染的粪便样品的全病毒。Wang等[62]发展了一种高集成的微流控系统。使用一个通用适配体，可区分三种不同的流感病毒(H1N1、H3N2和乙型流感)，为快速诊断流感病毒提供了新方法。Bai等[63]筛选出针对灭活的完整H1N1病毒颗粒的DNA适配体。其截短序列用于酶联寡核苷酸吸附实验(ELONA)，H1N1检测限(LOD，S/N=3)为0.3 ng/μL。在电化学阻抗(EIS)适配体传感器中，LOD增大了300倍(0.9 pg/μL)，且选择性优于其他病毒(>100倍)。此适配体传感器为更安全、更简单诊断病毒提供新手段。

3.2 人类免疫缺陷病毒

1981年，在美国首次发现人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)，其是造成人类免疫系统缺陷的一种病毒。其感染者潜伏期长、死亡率高，目前无特效治疗药物和预防的有效疫苗抑制艾滋病病毒的感染。因而利用核酸适配体快速诊断艾滋病病毒，并能抑制艾滋病感染具有重要意义。Yamamoto等[64]筛选出对Tat蛋白具有强亲和力的RNA适配体，可明显抑制HIV的活性。Kim等[65]筛选了针对人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)核衣壳(NC)蛋白的RNA适配体。它可抑制病毒基因组RNA的包装，有望成为有效的抗HIV治疗药物并用于疾病治疗。Faure等[66]证实在nmol范围内，寡核苷酸(ODN)93del可作为HIV-1聚合酶体外的有效抑制剂。Stefano等[67]发展了一种基于高亲和力DNA适配体定量检测HIV RT活性的新方法。此方法简单、灵敏度高，RT和病毒体检测限分别为≤6 400 个分子(～4×10-8个单位)和100～300个病毒粒子，并在至少104的范围内是线性的，为病毒的检测提供了有效的方法。

3.3 肝炎病毒

肝炎病毒是指引起病毒性肝炎的病原体。人类常见的肝炎病毒有甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)等。甲型肝炎感染后患者可获得持久的免疫力,因而相关研究较少。乙肝疫苗接种是有效控制HBV传播的必要手段。Zhang等[68]筛选出针对HBV核蛋白(HBc)的适配体Apt.No.28。此适配体可抑制核衣壳的组装，从而抑制HBV复制。因此可作为一种新型靶向分子，进行靶向治疗以及HBV相关疾病的药物开发。HCV是慢性肝炎、肝硬化和肝癌的常见原因，目前尚未获得批准HCV疫苗，且核酸适配体在此领域处于初始研究阶段，开发HCV有效的诊断与治疗试剂仍然是很有必要的。Chen等[69]筛选了特异性结合HCV包膜表面糖蛋白E2的功能性DNA适配体。此适配体ZE2可特异性捕获和诊断HCV颗粒，亦可抑制E2蛋白与HCV上受体蛋白CD81的结合，从而阻断HCV感染细胞。Yu等[70]筛选出针对HCV NS5A蛋白质的适配体。适配体NS5A-4和NS5A-5可抑制HCV RNA复制，从而抑制病毒的产生。NS5A的适配体可用于研究病毒复制和组装的机制，亦作为丙型肝炎的潜在治疗剂。Ghanbari等[71]发展了一种新型电化学适配体传感器用于HCV超灵敏检测。制备的适配体传感器可以准确地检测人血清样品中的HCV抗原浓度，为临床诊断中快速、高灵敏、高选择性检测HCV抗原提供了新的途径。

3.4 其他病毒

Chekin等[72]利用HPV-16 L1蛋白的RNA适配体，发展了一种检测HPV的电化学传感器，检测限为0.1 ng/mL。Hong等[18]3轮筛选出针对埃博拉病毒的核酸适配体，并成功应用于它的检测。严重急性呼吸系统综合症冠状病毒(SARS-CoV)是新出现的疾病SARS的病原体。Ahn等[73]使用SARS-CoV的N蛋白的高亲和力RNA适配体，可高灵敏地检测浓度低至2 pg/mL的N蛋白。Liang等[74]筛选出针对狂犬病毒的核酸适配体GE54，此适配体可保护小鼠免受RABV攻击，有望在临床上用作针对RABV感染的特异性抗病毒治疗试剂。

4 结论

病毒性疾病因其高发病率和死亡率是人类生命健康的重要威胁，高亲和力和特异性的核酸适配体为其防控提供了新的手段。微流控芯片因体积小、流体可控、比表面积大、自动化、集成化和高通量的特点，在核酸适配体筛选中能够减少样品与试剂的消耗，节约成本和增加筛选条件的可控性，进而提高筛选效率，为病毒的检测提供了高性能的亲和试剂。病毒性疾病因现存药物治疗方法带来的抗药性问题，给其治疗带来了新的挑战。

核酸适配体通过结合病毒侵染的关键位点，能够为病毒的治疗提供新的途径。目前在微流控芯片中以病毒为对象的核酸适配体筛选存在着筛选通量低，发展针对多种病毒的同时筛选是微流筛选的一个重要研究方向。同时，筛选出的适配体结合微流控芯片进一步研究其对病毒侵染能力的抑制，也将是未来病毒的防控和治疗提供新的解决手段。