太赫兹波谱在冬虫夏草检测中的应用

李 辰，魏丞昊，王志琪，黄略略，杨少壮

1) 深圳市太赫兹科技创新研究院, 广东深圳 518102；2)深圳大学计算机与软件学院, 广东深圳 518060；3)深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院,广东深圳518055

冬虫夏草为麦角菌科真菌冬虫夏草菌，是寄生在蝙蝠蛾科昆虫幼虫上的子座及幼虫尸体的复合体[1-2]．作为中国特有的名贵中药材之一，多产于中国四川、青海及西藏等省区，其活性成分包括核苷、甾醇、糖醇、氨基酸、脂肪酸、维生素类、多胺及多糖等[3-7]．由于生长环境特殊、生长周期较长、产量少以及不易采集等因素，相比其他虫草，冬虫夏草货源紧缺，价格昂贵．市场上冬虫夏草混伪品现象严重，不法分子为谋取暴利，以次充好、以假充真，常见混淆品如亚香棒虫草、新疆虫草、地蚕、古尼虫草、凉山虫草及甘遂等[8-11]，严重扰乱市场秩序和影响消费者身体健康．

太赫兹波指频率处于0.1～10.0 THz的电磁波，在食品、药品、生物化学及农业科学等领域具有重要应用价值[12-16]，生物大分子以及一些中药活性成分的振动及转动能级能量差与太赫兹频段的能级匹配，通过分析太赫兹波谱，能够反映样品内成分的细微差异[17-18]，如利用该技术在低温环境下发现异黄酮和人参皂苷的太赫兹波段特征吸收峰[19]．近些年，太赫兹波谱已广泛用于大黄、莪术及附子等中药材的鉴别和分析，太赫兹波谱对中药研究具有重要意义[19-21]．然而，尚未见应用于名贵中药冬虫夏草检测鉴别的研究报道．本研究利用透射及反射式太赫兹波谱技术，对正品及伪品类冬虫夏草进行检测和鉴别，旨在发掘太赫兹波段的鉴别依据，提供一种快速的伪冬虫夏草真鉴别方法．

1 材料与方法

1.1 样品制备

冬虫夏草正品和伪品信息如表1所示，共4种不同来源的正品冬虫夏草(正品1—4)，其中，正品1为固体微粉状态的冬虫夏草对照品(批号121201-201103)，其余正品均为完整冬虫夏草实物(图1)，购自品牌中药厂家．共3种冬虫夏草伪品(伪品1—3)，分别是亚香棒虫草、古尼虫草及地蚕，均为完整虫草实物，购自本地中药房．

表1 冬虫夏草样品来源及产地信息

图1 冬虫夏草正品和伪品实物Fig.1 Cordyceps sinensis and counterfeits

THz透射式检测样品制备采用粉末压片法，即完整冬虫夏草正品及伪品使用中药粉碎机粉碎后，放置在50 ℃烘箱干燥4 h，冷却后移至玛瑙研钵中充分研细，过200目筛．将过筛后的粉末与高密度聚乙烯(high density polyethylene, HDPE， 上海冠步科技)粉末充分混合，分别配制成100%和50%的质量浓度，称取约250 mg混合粉末，于35 MPa压强下制成厚度约2 mm、直径13 mm的薄片．本实验选择HDPE粉末作为样品的稀释剂与支撑剂，折射率稳定在1.51，在THz波段几乎无吸收[22]．

THz反射式检测样品制备采用样品切片法，将冬虫夏草样品用手术刀快速切制片状，厚度约为3 mm，表面平整，放置于反射式样品台待测试．

1.2 实验装置

采用TeraView公司生产的Terapulse 4000型太赫兹时域光谱仪(THz time domain spectroscopy, THz-TDS)，系统光谱范围为0.06～4.00 THz，光谱信噪比大于65 dB，光谱分辨率为1.2 cm-1．系统光路如图2，飞秒激光进入系统后经分光镜分束，一束泵浦光投射至THz 辐射源激发THz 脉冲，一束探测光经可控光学延迟线投射至THz 探测器．激发的THz 脉冲由离轴抛物面镜准直聚焦于样品表面，穿透或反射样品的THz 脉冲由抛物面镜聚焦到达THz 探测器上，实现样品太赫兹信号的采集．根据THz波探测样本的方式分为透射和反射两种模式．这两种检测模式采用不同的光路模组，经替换后可与相同的THz-TDS主体光路系统耦合并使用．

图2 太赫兹波谱成像系统示意图Fig.2 Schematic diagram of THz spectroscopy and reflective imaging system

1.3 研究方法

1.3.1 THz 透射式测量实验

将压片样品放入测试夹具中，固定于系统样品仓透射光路的聚焦处，密封样品仓腔体，获取实测部位的THz透射时域信号．实验过程中在密封腔体内持续充入氮气，使相对湿度小于5%，温度保持在约298 K．对同一样品均从3个不同位置测量并取平均，从而获取可靠的样品THz时域信号．

使用THz-TDS直接采集参考和样品的THz时域信号，其中，通过氮气(无样品放置)时获得的参考信号为Eref(t)， 通过厚度为d的压片样品获得的样品信号为Esam(t)， 经傅里叶变换后得到样品和参考频谱信号Esam(ω)和Eref(ω)， 则样品光谱响应函数为

(1)

其中，A(ω)为样品与参考信号的振幅比；φ(ω)为样品与参考信号的相位差；c为光速．依据Dorney等[23-25]提出的提取材料光学参数模型，可获得样品折射率n(ω)和吸收系数a(ω)分别为

(2)

(3)

可见，样品在THz波段的特征吸收峰、吸光度谱线趋势及平均折射率(及标准差)等波谱信息中反映了样品的本征信息，可为成分鉴别提供参考．

1.3.2 THz 反射式成像测量实验

开展基于THz-TDS的反射成像测量，将切片样品固定于样品台薄片上及反射光路焦点处，并对样品实施二维移动平台扫描，其中，横向测量区域为10 mm×10 mm，扫描步长均为0.1 mm，测量过程中保证切片样品均在实测成像区域内．通过对1951 USAF分辨率测试靶(R3L3S1P，Thorlabs)进行成像，测得该扫描设置下的横向分辨率为0.3 mm．实验过程中需向反射光路持续充入氮气，以减少测量误差．

采集完成后，重建THz时域数据能够呈现样品的THz切片图像，图像每个像素值代表该像素对应THz时域信号在同一延迟时间的幅值大小．使用Image J(1.51j8版)软件分析切片图像的信号强度分布，分析真伪冬虫夏草样品的内部结构区别．

2 结果与分析

2.1 真伪冬虫夏草的THz透射式图谱测定

图3为50%和100%质量浓度冬虫夏草对照品压片的太赫兹图谱．其中，图3(a)为两种质量浓度对照品与参考(氮气)的THz时域信号对比图．相比于参考信号，100%纯对照品透射信号峰峰强度衰减至参考信号的30%，相位时间延迟约3.9 ps，可由此估算样品折射率为1.6；而50%对照品随着样品质量浓度降低，压片内稀释剂含量增多，压片折射率小幅度下降，相位延迟略微变小．

图3 冬虫夏草对照品的太赫兹图谱Fig.3 THz time-domain signals, absorption coefficient and refractive index spectra of Cordyceps sinensis

图3(b)和图3(c)分别为不同质量浓度对照品压片在THz波段的吸收系数和色散曲线．图3(b)和图3(c)中插图分别为100%对照品压片于3个不同位置局部放大的吸收系数和色散曲线，可得1.01 THz处吸收系数标准差为0.10 cm-1，0.7 THz处折射率标准差为0.001．此外，冬虫夏草对照品在THz波段具有1.01 THz和1.13 THz(图中虚线)的2个特征吸收峰，随样品质量浓度增大，吸收峰强度逐渐增强，说明吸收峰与对照品内某种成分的存在相关．另一方面，冬虫夏草对照品的折射率在0.50～1.50 THz内呈现平稳下降趋势，且随质量浓度的增大，冬虫夏草折射率逐渐增强．不同质量浓度对照品压片在该波段的平均折射率分别为1.59±0.02(质量浓度为100%，0.02为该频段折射率值的标准差)和1.50±0.01(质量浓度为50%)．

为探寻冬虫夏草对照品的两个特征吸收峰，以及折射率特点是否适用于市面所售正品完整冬虫夏草，对同仁堂、义和祥及贯康品牌的冬虫夏草实施THz波谱检测．图4(a)为4种冬虫夏草正品的THz吸收系数曲线，可见，几种正品与冬虫夏草对照品吸光度谱线的一致性较好，且存在1.01 THz和1.13 THz特征吸收峰，说明这是所有冬虫夏草正品的共性特点，代表冬虫夏草中某些成分在THz频段的响应，也有可能是核苷、氨基酸、脂肪酸或多糖等代谢物共同作用的结果．图4(b)为4种正品冬虫夏草在THz频段的折射率谱，在0.5～1.50 THz波段，4种正品的平均折射率在1.59±0.04范围内，与对照品平均折射率结果接近．

另外，对比4种正品冬虫夏草的吸光度和折射率谱线发现，同仁堂冬虫夏草正品在整个THz频段的吸光度较其余三者更强，且随频率增大，同仁堂正品折射率谱线的下降趋势较其余三者快．初步推测可能与其冬虫夏草的采收产地不同有关，这可能成为今后鉴别冬虫夏草产地及道地性的重要依据．

图4 冬虫夏草正品的太赫兹图谱Fig.4 Absorption coefficient and refractive index spectra of four authentic Cordyceps

图5为对比几种常见冬虫夏草伪品与正品的太赫兹图谱．3种伪品均属虫草类．其中，在图5(a)和图5(b)的THz吸光度和折射率谱线中，伪品地蚕在0.1～2.0 THz并无冬虫夏草正品所含的特征吸收峰，且折射率与正品有较大的差距(Δn>12%)， 可能与地蚕的来源、科目和成分与冬虫夏草正品有较大区别所致，因此，可以通过冬虫夏草正品的特征吸收峰和折射率快速排除伪品地蚕的掺假．

图5 冬虫夏草正品和伪品的太赫兹图谱对比Fig.5 Absorption coefficient and refractive index spectra of counterfeit Cordyceps compared with results of authentic ones

另一方面，亚香棒虫草和古尼虫草的特征吸收峰与正品冬虫夏草的特征吸收峰位非常接近，仅有0.01的峰位差别，而吸收峰强度稍弱，无法直接利用特征吸收峰区别这两种伪品；在图5(b)所示的折射率图谱中，两种伪品在0.50～1.50 THz内，冬虫夏草的平均折射率在1.67±0.02，显著大于4种正品折射率．表2列举图5(b)中4种正品和3种伪品的平均折射率及标准差，相同频率下亚香棒虫草和古尼虫草的折射率与正品差异大于3%，反映了THz波谱在冬虫夏草真伪检测研究方面的技术可行性，在今后鉴别其他虫草类冬虫夏草真伪研究中具有一定参考价值．

表2 冬虫夏草正品和伪品的折射率信息

2.2 真伪冬虫夏草的THz反射式成像测定

图6为冬虫夏草正品及伪品的THz时域切片图像，能够呈现切片样品的轮廓和结构特点．各切片图像的时间延迟分别标注在各图像注解内；以地蚕(图6(f)，图示空心圈为A点位置，实心块为B点位置)为例，图7中列举了两点的THz时域信号和B-scan图像，其中，时域信号中包含重合的薄片前表面和后表面，以及表面位置差异较大的虫草表面，这是由于虫草表面本身不平整所造成．

图6 冬虫夏草正伪品在对应延迟时间的THz切片图像Fig.6 THz time-domain slice images of authentic Cordyceps and counterfeits at corresponding optical time delays

图7 地蚕切片图像中图6(f)标注的A点和B点 所对应THz时域信号和B-scan图像Fig.7 THz time-domain signals and B-scan images of point A and B noted inFig.6(f) of slice images of stachys geobombycis

为定量评估各正品和伪品结构轮廓特点，选取各样品切片图像内的轮廓面积，通过Image J软件计算各样品轮廓面积内的相对信号强度分布，如表3．可见，正品类3种冬虫夏草相对平均信号强度均小于50，而伪品类的相对平均信号强度均大于65，表明正伪品切片在成分和结构分布上具有一定区别，从而导致样品THz反射时域信号强度的差异，进一步从成像角度说明THz波谱技术在虫草鉴别研究的技术可行性．

表3 冬虫夏草正品及伪品切片图像相对信号强度分布

结 语

利用THz波谱和成像技术对4种正品冬虫夏草和3种伪品冬虫夏草进行鉴别研究，发现冬虫夏草正品存在1.01 THz和1.13 THz特征吸收峰．通过分析几种正品和伪品在THz波段的特征吸收峰位、折射率及切片成像等特征，评估正品和伪品之间的THz波谱共性特点和典型差异，为名贵中药冬虫夏草的真伪鉴别提供一定技术参考．

本研究仅对部分冬虫夏草样品和3种常见伪品提供鉴别分析，并未覆盖所有常见冬虫夏草伪品，如新疆虫草和凉山虫草等，后续研究将继续收集更多样本进行测试分析，建立模型，进一步挖掘波谱和图像特点．此外，冬虫夏草及某些伪品在THz频段的特征吸收峰还需确定吸收峰的归属类物质，开展进一步的研究和验证工作．THz波谱和成像数据能够反映冬虫夏草的一部分本征信息，可为今后该技术应用于冬虫夏草产地、道地性及品种品质甄别研究提供了一定的技术支持．