花椒籽发酵做固体饲料的研究

刘希旻， 任 健， 童应凯*， 陈添傲， 平炜杰， 付同帅， 顾逸飞

（1.天津农学院农学与资源环境学院生物技术系，天津 300384；2.天津农学院基础科学学院，天津 300384）

花椒籽富含蛋白质和粗脂质，并且资源丰富，是较好的脂肪源及蛋白源，然而花椒籽含有花椒酰胺类（麻味）物质和挥发油（香味）物质，会影响饲料的适口性。花椒酰胺虽然有抗炎抑菌的功能，但动物如果长期摄入会对胃部及肠道造成损伤（叶敏，2015）。花椒酰胺类物质中包括羟基-α-山椒素、羟基-β-山椒素、羟基-γ-山椒素等。其中以羟基-α-山椒素的含量为酰胺类物质检测的标准，主要采用紫外分光光度法检测花椒酰胺的含量。本文通过对实验室保藏菌种产朊假丝酵母（Candida utilis）、白地霉（Geotrichum candidum）、布拉迪酵母（Saccharomyces cerevisiae boulardii）及温莎啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的培育和筛选，旨在确定降解花椒酰胺类物质的菌种，并通过正交试验，寻找菌种的最佳生长条件及最佳生长元素添加量。以最大化地利用农后废物花椒籽，为养殖业提供一种植物蛋白和脂肪源的新选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 花椒籽粉、麸皮，市场购买；鲜花椒油，购自成都陈麻婆；石油醚、甲醛（分析纯），甲醇（优级纯），甲醇、正己烷（色谱纯），购自天津大茂；葡萄糖（分析纯），购自天津北方天医；酵母浸膏（生化试剂，天津英博）；蛋白胨（生化试剂，湖北安琪）；酵母浸粉LP0021（生化试剂，英国OXOID）；硫酸铵、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、氢氧化钠（均为分析纯，天津风船）；产朊假丝酵母、白地霉、布拉迪酵母、温莎啤酒酵母，均为天津农学院生物技术系实验室保藏菌种。

1.2 仪器与设备 粉碎机 （浙江荣浩）；分析天平（北京赛多利斯）；旋转蒸发仪RE-2000A （上海亚荣）；紫外可见分光光度计（北京普析通用）；低速离心机L550（湖南湘仪）；恒温水浴锅HH-4（金坛市瑞华）；KH5200DB型超声波清洗器（昆山禾创）；恒温培养振荡器（天津欧诺）；飞利浦紫外线灯（上海赖氏）；生物洁净工作台（苏州安泰）；血细胞计数板（上海求精）；生化培养箱SHP-250B（江苏宏凯）。

1.3 培养基 YEPD培养基：葡萄糖2%、酵母浸膏 1%、蛋白胨 2%，pH 6.0，121℃灭菌 20 min。

沙氏培养基：葡萄糖4%、蛋白胨1%，pH自然，121℃灭菌20 min。

中性红油脂培养基：花椒油10%、酵母浸粉1%、硫酸铵0.2%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸二氢钾0.3%、硫酸亚铁0.01%、0.1%中性红指示液0.3 mL，pH 7.2～7.5，121℃灭菌20 min。

固体发酵培养基：花椒籽粉9 g、麸皮1 g、蒸馏水10 mL，pH自然，121℃灭菌20 min。

1.4 试验方法

1.4.1 花椒籽中油脂含量的测定 国标规定饲料粗脂肪含量为10%以上（含10%）。本试验采用抽提法测定花椒籽中油脂含量（马荣萱等，2006）。称取8 g花椒籽粉，滤纸包好置于索氏提取器中，加入80 mL石油醚，置90℃水浴，回流虹吸15次停止加热，待冷却后，减压蒸馏，直至无提取剂气味，即为花椒籽油脂（表1）。

表1 花椒籽中油脂含量测定表

1.4.2 油脂降解菌的筛选 饲料中脂肪过多，会引起动物消化不良、腹泻，且不利于存储，因此需进行油脂降解菌的筛选。将产朊假丝酵母、白地霉、布拉迪酵母、温莎啤酒酵母接种于中性红油脂培养基上，置于生化培养箱中28℃培养48 h后进行观察。

1.4.3 花椒酰胺类物质标准品的制备 羟基-α-山椒素制备参照刘福权等（2017）的方法。花椒油与甲醇按体积比1:20，于40℃，160 r/min振荡1 h后，超声5 min。4000 r/min离心15 min，取上清液加入正己烷，体积比为1:2，萃取3次除去香味物质。将下层液过碱性三氧化二铝层析柱，所得液经0.22μm滤膜过滤后，进行减压蒸干，得到粗提取物。将粗提取物溶于10 mL色谱纯甲醇，于紫外灯下15 cm处照射4 h，再进行减压蒸干。经甲醛滴定法平行检验 （江燕竹，2016），获得纯度为98.21%的羟基-α-山椒素标准品。

1.4.4 花椒酰胺类物质标准曲线的测定 将制取的羟基-α-山椒素标准品溶于一定量的甲醇中，再配制成不同浓度的溶液，在254 nm下测定吸光度，绘制标准曲线（图1）。

图1 羟基-α-山椒素含量标准曲线

1.4.5 花椒酰胺类降解菌的筛选 将产朊假丝酵母、布拉迪酵母、温莎啤酒酵母接种于50 mL YEPD培养基中，白地霉接种于50 mL沙氏培养基中，于摇床中30℃，150 r/min培养24 h后，移取1 mL种子液接种于固体发酵培养基中。置于生化培养箱中28℃培养48 h，将发酵产物各精确称取1.00 g移入10 mL离心管中，加入5 mL甲醇，在40℃下浸提4 h，其间不断摇动，离心后取上清液稀释，在254 nm处测定其吸光度值（付陈梅等，2003）（表 2）。

表2 不同菌种降解花椒酰胺类物质残留量比m较g/g

1.4.6 微量元素正交试验 对产朊假丝酵母、白地霉，单一菌种及混合菌种进行L9（34）的固体发酵生长元素添加条件试验设计见表3。

表3 微量元素添加条件正交试验设计表%

1.4.7 生长条件正交试验 对产朊假丝酵母进行L9（34）的生长条件试验设计见表 4。

表4 产朊假丝酵母、白地霉混合发酵生长条件正交试验设计表

2 结果与分析

微量元素正交试验结果分析见表5和表6。由R值可知，影响产朊假丝酵母降解的微量元素添加条件依次为葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁；影响白地霉降解的微量元素添加条件依次为硫酸铵、葡萄糖、硫酸镁、磷酸二氢钾。

表5 产朊假丝酵母、白地霉单一菌种发酵微量元素添加条件正交试验结果

表6 产朊假丝酵母、白地霉单一菌种发酵微量元素添加条件显著性比较（LSD法）

由R值可知，影响产朊假丝酵母、白地霉混合发酵降解的微量元素添加条件依次为硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、葡萄糖（表7、表8）。

由R值可知，影响产朊假丝酵母、白地霉混合发酵降解的生长条件依次为接种量、时间、料液比、温度（表 9、表 10）。

3 结论

本试验结果表明，固体发酵降解花椒酰胺类物质的最优混合菌种为产朊假丝酵母和白地霉。对比单一菌种发酵，混合菌种降解花椒酰胺类物质时间短，降解能力高，并大大降低了花椒籽粉中的挥发油类（香味）物质。经正交试验确定混合菌种的最佳降解生长条件为：温度28℃，料液比1:1，接种量10%，时间24 h。生长元素添加最佳条件为：（NH4）2SO40%，KH2PO40.2%，Mg-SO40.01%，葡萄糖0.5%。经重复试验验证，花椒酰胺类物质平均残留量为3.5776 mg/g。且发酵产物经感官性评价无花椒挥发油气味，麻味明显下降，油脂含量适中。

表7 产朊假丝酵母、白地霉混合发酵微量元素添加条件正交试验结果

表9 产朊假丝酵母、白地霉混合发酵生长条件正交试验结果

表8 产朊假丝酵母、白地霉混合发酵微量元素添加条件显表著性比较（LSD法）

10 产朊假丝酵母、白地霉混合发酵生长条件显著性比较（LSD法）