HPLC-DAD法检测桑叶中的1-脱氧野尻霉素

高林森，温吉更，李亚丽，郭 烨

（河北省农林科学院农业信息与经济研究所，河北石家庄 050051）

我国桑叶资源十分丰富，分布面积广，但在桑叶的利用方面较差（姜贝贝等，2017）。桑属植物中含有丰富的生物碱。目前已从桑属植物中分离出十几种多羟基生物碱，其中，1-脱氧野尻霉素（1-DNJ）在桑叶中含量较多。1-DNJ是存在于桑属资源中的一种特殊多羟基生物碱，结构和天然糖相似，是桑叶降血糖的主要活性成分。1-DNJ能够很好的竞争性抑制α-糖苷酶的活性，因此可以用于肥胖病、糖尿病、抗病毒感染等 （姚佳等2018；Shuang 等，2017；Wen 等，2016；Islam 等 2008），其在体内停留时间较短，无需肝脏代谢，无毒性积累，无细胞及遗传毒性，无代谢副产物，也不会损伤肝肾（王玲等，2017）。

本实验主要研究桑叶中1-DNJ的定性定量检测及对检测条件进行优化，然后对不同种植条件下桑叶1-DNJ含量的差异性进行对比，预期找到合适的方法来测定样品中的1-DNJ，为 1-DNJ的开发和应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 本实验所用材料和试剂如表1和表2所示。

表1 实验药品

1.2 仪器与设备 本实验所用实验仪器如表3所示。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液的配制 精确称取2 mg DNJ标准品，用超纯水配制成 2、1、0.5、0.25、0.125、0.05 mg/mL的标准溶液。

1.3.2 样品处理 准确称取桑叶粉 0.5 g，加入0.05 mol/L HCl 20 mL，静置 10 min，超声处理30 min，10000 r/min 离心 30 min，收集上清液，沉淀物重复抽提1次，合并2次上清液，用0.05 mol/L HCl定容至 50 mL，得桑叶粉样品提取液。

1.3.3 1-DNJ的衍生化处理 分别取待测样品提取液、1-DNJ标准品溶液各 100μL，加入0.4 mol/L K3BO3缓冲液（pH 8.5）100 μL、5 mmol/L FMOC-Cl溶液（溶解于 50%乙腈）100 μL，混匀，静置 30 min，进行衍生化反应，然后加入 1 mol/L甘氨酸溶液100μL，终止反应，最后加入0.1%乙酸溶液 100 μL，混匀静置 2 h（魏兆军等，2009）。用0.22μm微孔过滤器过滤，收集滤液待测。

表2 实验原材料

表3 实验仪器

1.3.4 色谱条件 岛津 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相为 V（乙腈）：V（0.1%乙酸）=40:60混合液，流速 1.0 mL/min，进样量 20μL，柱温30℃，检测波长 265 nm。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择 实验利用二极管阵列检测 器（DAD）的优势，同时选取 254、265、270、275 nm四个波长进行高效液相色谱分析，不同波长下1-DNJ的高效液相色谱图见图1。由图1可知，在吸收波长为265 nm时，1-DNJ的吸收值最高，其次为254 nm，虽然相差不大，但是在265 nm波段时，测定样品中的干扰杂质溶出较少，便于检测，所以最终1-DNJ的检测波长应为265 nm。

图1 不同波长下1-DNJ标品液相色谱图

2.2 流动相的选择 实验比较了0.1%已酸水溶液与乙腈的体积比分别为60:40、55:45和65:35时，1-DNJ样品的色谱分离情况。不同流动相比例下1-DNJ样品的高效液相色谱图见图2。当体积比为55:45和65:35时，样品中杂质出峰时间与被分析物出峰时间相近，不能完全分离，且目标物质吸收值较低。当体积比为60:40时分离效果良好。因此，选择体积比为60:40的0.1%已酸水溶液-乙腈为流动相。

2.3 线性关系与检测限 根据分析物的灵敏度， 配制含 1-DNJ 质量浓度为 2、1、0.5、0.25、0.125、0.05 mg/mL的标准溶液，在选定的色谱条件下进行测定，用峰面积对标准溶液中分析物的浓度做图，其线性方程、线性相关系数及线性范围如表4所示，线性关系图见图3。分析物在浓度0.05～2 mg/mL内线性关系良好。

2.4 样品测定 桑叶样品按照 1.3中的方法进行处理、衍生和测定。通过对比标准样品色谱图、空白色谱图和桑叶提取液色谱图。结果如图4所示，1-DNJ分离效果好且保留时间合适。

2.5 回收率和精密度实验 对多个桑叶样品分别在 0.05 mg/mL和 0.125 mg/mL 2个添加水平下进行加标回收率实验，结果见表5。 其平均回收率（AR）为81.3% ～92.1%，相对标准偏差（RSDs）为 4.7% ～6.5%（n=5）。 表明该方法回收率和精密度高，分析方法可行，可用于桑叶中1-DNJ的定性与定量分析。

图2 不同流动相比例下1-DNJ样品色谱图

表4 线性回归方程及相关系数

图3 线性回归曲线图

2.6 不同种植条件下1-DNJ含量差异性对比将多产地春季、秋季不同品种的桑叶分别经冻干后，测得1-DNJ含量见表6。分析结果表明，桑叶季节性1-DNJ含量差异较大，秋季桑1-DNJ高于春季桑1-DNJ，承德产区秋季桲椤桑的1-DNJ含量最高，为0.105 mg/mL。检测结果为河北省桑叶的产品研发及1-DNJ的有效利用提供了理论依据。

图4 标准样品、空白和桑叶提取液色谱图

表5 样品加标回收率与精密度（n=5）

3 结论

本实验结果表明，目标色谱峰分离效果好，峰面积与1-DNJ浓度呈高度正相关关系，样品平均加标回收率为81.3%～92.1%，相对标准偏差（RSDs）为 4.7% ～ 6.5%（n=5），精密度、稳定性、重现性、回收率的测定结果均显示本方法是稳定可靠的，可用于桑叶中1-DNJ的检测。而且对多种桑叶样品进行检测，检测结果显示，秋季桑中1-DNJ的含量高于春季桑，承德产区秋季桲椤桑的1-DNJ含量最高。

表6 桑叶中1-DNJ含量（n=5）