改良QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱法检测饲料中的7种镇静剂

张 虹， 何晓明

（1.浙江财经大学会计学院，浙江杭州 310018；2.绿城农科检测技术有限公司，浙江杭州 310052）

镇静剂是指对中枢神经系统产生抑制作用，减弱其生理机能从而缓和激动、消除躁动、恢复安静情绪的药物（魏晋梅等，2016）。近年来，个别畜牧业饲养者在饲养过程中将镇静剂添加至动物饲料中以达到镇静催眠、快速催肥和缩短出栏时间的目的。此外，在动物运输、检疫、屠宰前，也常使用此类药物以减少应激带来的损失（张烁等，2014）。有研究表明，残留在动物体内的镇静剂会随着食物链进入人体内，对人体中枢神经系统造成不良反应（严丽娟等，2013）。目前，我国明确规定在动物养殖过程中严禁添加镇静剂类药物（中华人民共和国农业部，2002）。因此，建立一种快速、高效、灵敏的饲料中多种镇静剂的监测方法对确保食品动物质量安全具有重要意义。

目前，镇静剂检测方法主要包括酶联免疫法（ELISA）（李桂敏等，2014；孙文佳等，2012）、气相色谱-质谱法（GC-MS）（汪丽萍等，2005）、液相色谱法（HPLC）（罗慧玉等，2017）和高效液相色谱-串联质谱法 （HPLC-MS/MS）（孙珊珊等，2018；刘家阳等，2017；朱群英等，2016）。 其中 HPLC-MS/MS法灵敏度高、选择性和抗干扰能力强，成为最常用的检测方法。

由于饲料基质复杂，易对分析造成干扰。现有的国标方法与文献报道多采用固相萃取法对样品进行净化处理，虽然结果重现性好，但存在操作繁琐、处理时间长、成本高等问题。QuEChERS前处理方法具有快速、简单、廉价、有效、可靠、安全的特点，已被广泛用于兽药残留分析（Xu等，2018；田海伟等，2017；刘永涛等，2017）。本实验采用增强型去除脂类基质吸附剂（EMR-Lipid）对饲料样品进行净化，旨在建立饲料中7种镇静剂的测定方法。

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂 LC-MS/MS 8050三重四级杆液相色谱-串联质谱仪 （日本Shimadzu公司）；ST16R高速冷冻离心机 （美国Thermo公司）；Multi Reax全能型振荡器 （德国Heidolph公司）；R215旋转蒸发仪 （瑞士Buchi公司）；Milli-Q Reference超纯水机（美国Millipore公司）。

甲酸、乙腈和甲醇（HPLC级，美国Thermo公司）；EMR-Lipid（美国 Agilent公司）；石墨化炭黑（GCB）、C18 及 N-丙基乙二胺（PSA）（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；实验用水为Milli-Q超纯水；其他试剂均为国产分析纯试剂。

氯丙嗪（纯度99.2%，德国 Dr.Ehrenstorfer公司）；地西泮、艾司唑仑、咪达唑仑、安眠酮、塞拉嗪、利血平（纯度均大于95%，美国CerilliaIlt公司公司）。

1.2 标准储备液的配制 用甲醇分别配制7种镇静剂标准品的10 mg/L的单标准储备溶液，于4℃下避光保存。用时根据需要用空白基质提取液逐级稀释配成适当浓度的混合标准工作液。

1.3 样品前处理 饲料样品经粉碎均匀后制成待测样，于室温下密封保存。称取2.0 g待测样品于50 mL聚乙烯离心管中，加入10 mL超纯水，涡旋振荡1 min后，加入2.0 g EMR-lipid和10 mL乙腈，涡旋振荡10 min，再加入4.0 g无水硫酸钠和1.0 g氯化钠，涡旋振荡2 min，8000 r/min高速冷冻离心3 min。 取上清液约8 mL置于装有100 mg C18、50 mg PSA和200 mg无水硫酸钠的15 mL离心管中，涡旋振荡2 min，8000 r/min高速冷冻离心3 min。取5 mL上清液至10 mL试管中，40℃氮吹至干，用1 mL初始浓度流动相复溶，经0.22μm滤膜过滤后，上机测定。

1.4 测定方法

1.4.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱温：40 ℃；流速：0.35 mL/min；进样量：2 μL；流动相：A 相为 0.1%甲酸水溶液，B相为0.1%甲酸甲醇溶液；梯度顺序：0 ～ 0.5 min，10%B；0.5 ～ 2.5 min，10% ～ 25%B；2.5 ～ 5.0 min，25% ～ 95%B；5.0 ～ 6.0 min，95%B；6.0 ～ 6.5 min，95% ～ 10%B。

1.4.2 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）：正离子模式；温度：400℃；毛细管电压：4000 V；雾化气流量：3.0 L/min；加热气流量：10.0 L/min；定性与定量离子对、碰撞能量等参数见表1。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化 7种镇静剂均属于弱碱性化合物，因此选择在正离子模式下对目标物进行质谱条件的优化。分别采用全扫描和子离子扫描方式优化得到了母离子、子离子及各自的质谱参数。根据EU第657/2002/EC号决议中有关规定中有关质谱分析方法必须不少于4个识别点的规定，选择两对质谱响应最佳的监测离子对及相应参数作为最终质谱采集参数，优化的质谱条件见表1。

表1 7种镇静剂的质谱参数

2.2 色谱条件优化 本实验考察了甲醇-水和乙腈-水2种流动相体系在相同梯度洗脱条件下，对7种镇静剂的分离度、灵敏度和峰型的影响。使用甲醇-水体系时能获得较好的分离效果和仪器响应。考虑到目标均采用正离子模式，比较了在流动相中加入不同浓度甲酸溶液对色谱分离和质谱响应的影响。结果发现，加入0.1%的甲酸后各目标物的质谱响应有显著提高，峰型也较好，与孙珊珊等（2018）报道结果相似。最终选用0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水作为流动相，在优化的条件下7种镇静剂总离子流图见图1。

图 1 7 种镇静剂（5 μg/L）的总离子流（TIC）色谱图

2.3 提取条件优化

2.3.1 提取条件的优化 兽药残留检测常用的提取试剂有甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。甲醇能与水互溶，盐析效果不佳。本实验比较乙腈与乙酸乙酯2种提取试剂对7种镇静剂的的提取效果。结果表明，两者提取效果相当，但考虑到饲料样品中蛋白质含量较高，乙腈具有沉淀蛋白质的作用，能在一定程度上减少基质效应，因此选择乙腈作为提取试剂。

饲料样品中含有较多的脂肪，在提取过程中会被一起提取出来，不利于QuEChERS的净化。参考李诗言等（2017）的方法，在盐析提取前加入EMR-Lipid用于除去样品中的脂类物质，可有效提高净化效率。实验考察了EMR-Lipid添加量为0.5、1.0、2.0、3.0 g 时对样品的净化效果（图 2），结果表明，当EMR-Lipid添加量为2 g时，即可满足实验要求。

图2 EMR-Lipid添加量对7种镇静剂回收率的影响

2.3.2 净化条件的优化 采用乙腈和EMR-Lipid虽然去除样品中大部分的蛋白质和脂类物质，但是提取液中还残留少量脂肪和色素等干扰组分需进一步净化。本实验采用QuEChERS法对样品提取液进行进一步净化。QuEChERS法常用吸附剂有GCB、C18及PSA。GCB对色素去除效果较好，但对具有平面结构的目标物也有较强的吸附作用，所以不予考虑；C18具有良好的除脂能力；PSA可有效去除色素和糖类。本实验考察PSA和C18的最佳使用量 （图3）。结果显示，采用100 mg C18、50 mg PSA及200 mg无水硫酸钠为净化剂组合时，样品可以获得良好的净化效果，基质干扰小，且不会对目标物产生明显吸附。

图3 不同净化剂组合对7种镇静剂回收率的影响

2.4 基质效应 基质效应在液相色谱-串联质谱分析中普遍存在，是基质成分和目标物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争所致 （周悦榕等，2017）。分别配制浓度为空白饲料基质匹配标准曲线以及对应质量浓度的纯溶剂标准曲线，通过两者的斜率比值评价基质效应。由表2可知，7种镇静剂斜率为0.583～0.801，说明虽然经过净化，但由于饲料基质复杂，部分目标物仍存在较强的基质抑制作用。因此本方法仍采用基质匹配标准曲线法进行校正补偿，以消除基质效应对检测的干扰。

表2 7种镇静剂的线性方程、回归方程、相关系数和定量限

2.5 线性范围和定量限 用空白饲料样品基质提取液配制7种镇静剂的系列混合标准溶液，在优化的实验方法下进行测定，以目标物定量离子的峰面积为纵坐标（y），质量浓度为横坐标（x），绘制标准曲线。结果表明，7种镇静剂线性关系良好，相关系数均≥0.99。

同时，以3倍信噪比确定目标物的检出限（LOD）为 1.1～2.8μg/kg，以 10倍信噪比确定目标物的定量限（LOQ）为3.7～9.3μg/kg。

2.6 回收率与精密度 选取空白配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料样品分别添加高、中、低3个水平的混合标准溶液，每个水平平行测定6次。结果如表3所示，7种镇静剂平均回收率为84.7%～96.5%，相对标准偏差为3.2% ～10.8%，满足GB/T 27404-2008中食品中禁用物质质量分数＜0.1 mg/kg时，回收率为60%～120%的规定（中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，2008）。

表3 空白样品中7种镇静剂的回收率和相对标准偏差（n=6）

2.7 与其他方法的比较 与现行国标方法和相关文献报道方法（孙珊珊等，2018；中华人民共和国农业部，2007）相比，本文建立的前处理以EMR-Lipid为吸附剂的QuEChERS方法可直接净化提取液，有效吸附饲料中脂溶性杂质，省去了柱活化、上样、淋洗再洗脱的SPE过程，操作简单快速、溶剂用量小、检测成本低，适用于大批量样品快速检测。。

2.8 实际样品的分析 分别对日常送检的配合饲料、浓缩饲料和预混饲料各10份进行7种镇静剂残留的检测，结果表明，所有饲料样品均未发现这7种镇静剂。

3 结论

本实验将吸附剂EMR-Lipid应用到QuECh-ERS方法中，并结合HPLC-MS/MS建立了饲料中7种镇静剂的快速检测方法。结果表明，该方法简单方便、灵敏度高、准确，能满足饲料中7种镇静剂的检测要求，对于其他镇静剂类药物也具有较高的参考价值。