牙根发育机制的研究进展

李燕玲，陈 柯

1暨南大学口腔医学院，广东 广州 510000；2南方医科大学口腔医院，广东 广州 510000

牙的发育是连续而复杂的生理过程，是牙源性上皮与间充质相互作用的结果，包括帽状期、蕾状期、钟状期、牙根的发育和牙齿的萌出[1]。牙根的发育始于牙冠发育完成后，由精细而复杂的信号网络调控完成。牙源性干细胞的发现为牙组织工程带来了许多未知的可能，其中牙源性干细胞与牙根发育机制的联系至关重要，研究牙根发育的机制可为牙组织工程指明方向。本文从牙根发育的过程、影响牙根发育的相关因子及牙源性干细胞与牙根发育机制的联系三个方面对牙根发育机制的进展进行阐述。

1 牙根发育的过程

牙根发育由上皮和间充质细胞的相互作用指导完成，牙冠发育即将完成时，牙釉质的发育转变为牙骨质的发育，此时形成釉牙骨质界的分界线。成釉器的内釉上皮和外釉上皮在颈环处增生，向未来的根尖孔方向生长，这种双层细胞的结构称为上皮根鞘（HERS）。上皮根鞘由两层上皮细胞组成，包括内釉上皮和外釉上皮，而成釉器的另外两个结构——中间层和星网状层消失，这可以认为是牙冠发育向牙根发育过渡的转变[1]。上皮根鞘分泌多种因子，可诱导牙乳头细胞向成牙本质细胞分化，若其连续性遭到破坏，则会引起牙根发育异常。第一层牙本质形成之际，上皮细胞与牙本质表面分离，断裂形成网状，牙囊细胞穿过上皮根鞘再移向根部牙本质，分化为成牙骨质细胞，分泌牙骨质基质。此外，部分浸润的牙囊细胞在牙本质或周围的上皮根鞘细胞的诱导下，分化为成牙骨质细胞，在牙根表面和牙周膜纤维的周围分泌有机基质，将牙周膜纤维埋在有机基质中，形成原发性牙骨质[2-3]。

形态学上，上皮根鞘位于牙乳头和牙囊之间，是二者的边界，上皮-间充质的相互作用对牙根形成有重要作用。上皮根鞘与间充质的成牙本质细胞与成牙骨质细胞相互影响调控，共同调节根部牙本质和牙骨质的形成，从而调控牙根的发育，其中是通过复杂而精细的信号通路相互调控联系的，如骨形态发生蛋白（BMP）、成纤维细胞生长因子（FGF）、刺猬家族蛋白（Shh）、Wingless（Wnt）、核因子I（NFI）家族成员C（Nfic）等，而这些信号通路的作用机制尚未明确[4]。

2 影响牙根发育的相关因子

2.1 Nfic/Osx转录因子

Nfic存在于牙根发育时期的牙乳头间充质细胞内，对根部牙本质形成起到重要作用。Osx是一种含锌指结构的转录因子，在所有发育的骨骼中特异性表达，缺乏Osx的小鼠没有骨组织的形成[5]。研究发现，Nfic的破坏会损坏成骨细胞的分化和骨组织的形成，而Nfic直接调节Osx的表达，Osx是BMP Runx-2的下游靶基因[6]。Runx-2主要调控早期的牙根发育，而Osx通过调控成牙本质细胞的分化从而影响牙根的后期发育[7-8]。

缺失Osx的斑马鱼突变体显示牙本质形成受阻，成牙本质细胞极性消失，仅有一层薄薄的牙本质形成。在突变体中，破骨细胞活性仍然存在，推测Osx缺失时，牙根发育的程序仍正常进行，但此时形成的牙根缺乏附着骨及正常的方向，同时牙髓组织受损[9]。

为研究Nfic-Osx信号通路与牙根发育的关系，Kague等[9]敲除小鼠的Osx基因（与2.3 kb Col 1-Cre杂交），发现条件敲除小鼠细胞增殖增加，而牙本质基质蛋白（DMP1和DSPP）表达显著降低，导致成牙本质细胞分化被抑制，形成了含有少量牙本质小管的短而薄的牙根。Kim等[10]也研究了Osx在成牙本质细胞特异性失活的影响，研究发现，Osx条件敲除小鼠具有正常的冠部、短根以及较薄的根部牙本质，牙根的延长受到影响。证明，Osx影响牙根后期的发育，但跟牙冠的发育没有关联。除此之外，Osx不仅影响成牙本质细胞的分化与根部牙本质的形成，也与成牙骨质细胞的分化和牙骨质的形成有关。Osx敲除小鼠的短而细长的牙根或许可以为临床上类似的牙齿疾病找出病因，从而提供治疗的方向[7]。

2.2 骨形态发生蛋白（BMP）

BMP信号通路在牙齿发育起始定位、形态发生和细胞分化过程中发挥十分重要的作用，其配体、受体及靶基因的缺失都会引起牙齿发育发生明显的缺陷[11]。牙根发育过程中，Bmp信号通路在调节HERS的形成和成牙本质细胞的分化时十分活跃，Bmp2，3，4和7在牙根发育起始时均有表达[12]。Bmp信号通路异常或其相关基因缺失可导致牙根发育异常。

β-连环蛋白调节成牙本质细胞的增殖分化，小鼠成牙本质细胞特异性基因Ctnnb1（编码β-连环蛋白）缺失导致Bmp7表达升高，而BMP拮抗剂noggin和卵泡抑素的表达减少，同时HERS细胞中磷酸化Smad1/5/8的水平增加，Smad1/5/8是BMP的经典依赖途径，一系列的变化导致BMP7表达增多，最终观察到小鼠HERS的连续性遭到破坏，证明β-连环蛋白在牙根发育的连续性方面起到重要作用[13]。

Noggin是BMP信号的一种蛋白抑制剂，对BMP有负反馈调节作用，对Wnt有正反馈调节作用，其机制可能是通过BMP影响[14]。Harmine是一种天然的小型化合物，可在体内或体外刺激成骨细胞分化，可诱导HERS、牙囊、牙乳头细胞的smad1/5/8磷酸化，从而促进HERS的延长和牙囊及牙乳头相关细胞的增殖分化。FGF2蛋白存在的情况下，BMP2可增多HERS细胞的分化，因此，FGF2蛋白可增强BMP2依赖的HERS细胞生长。间充质细胞的BMP2基因中敲除SP7可导致短而薄的牙根形成，且细胞牙骨质形成失败。HMN以剂量依赖性方式激活细胞增殖活性与FGF2蛋白协同作用，因此，HMN重复了BMP2-Smad1/5/8通路的一些生物学效应从而影响牙根发育[9]。

2.3 Wnt信号通路

Wnt信号通路包括经典Wnt/β-catenin信号通路、非经典Wnt/Ca2+信号通路和Wnt/PCP信号通路[10]。Wnt信号通路在牙根发育过程中有重要意义，而β-连环蛋白是Wnt信号通路经典途径的关键因子，对骨组织的形成至关重要[15]。

突变小鼠牙根成牙本质细胞中Wnt10a和Axin2表达显着降低。证明在成牙本质细胞中删除Wls基因似乎减少了经典的Wnt活性，导致成牙本质细胞成熟和牙根延长受到抑制[16]。

经典途径的Wnt信号通路研究较多，而对非经典途径知之甚少。非经典Wnt信号传导以多种方式抑制经典Wnt信号传导。Wnt5a通过抑制β-连环蛋白/TCF介导的转录下游的信号传导来抑制Wnt3a介导的ALP表达增加，Wnt5a由牙囊细胞和前体细胞/成牙骨质细胞系细胞表达。此外，Wnt5a信号通路抑制Wnt3a介导的牙囊细胞中ALP表达的增加，表明Wnt5a在根形成期间对牙囊细胞的成牙本质/成骨细胞分化中可能具有负调节作用[17]。

Wnt3a抑制成骨细胞分化，同时降低小鼠成骨细胞中Alp1和Osx的表达水平，诱导Runx2的转录活性以及小鼠牙囊细胞中ALP和Osx基因和蛋白质水平的表达。Wnt3a是在牙根发育期间由HERS细胞分泌，牙囊中的Wnt信号通路通过Osx而不是Runx2来诱导早期的成牙骨质细胞或成骨细胞分化[18]。

2.4 其他与牙根发育相关的基因

Wang等[19]将壳聚糖Clcn7-siRNA纳米颗粒注射至新生小鼠的第一磨牙胚周围作为实验组，结果导致牙齿萌出过迟和牙根发育异常。取E13.5 d小鼠的下颌第一磨牙牙胚，转染Clcn7-siRNA慢病毒感染体，移植至肾被膜下，与Clcn7功能正常的牙胚比较，Clcn7功能障碍的牙胚中生成的牙本质、牙骨质及牙周膜发生异常。这种牙齿的改变在Clcn7突变体病人中也有报道[20]。ClC-7的缺乏可能在以下几个方面影响牙齿的发育和萌出：可能直接影响牙釉质和牙本质的形成和钙化；或者阻碍牙乳头细胞的分化从而影响牙根的发育。

Btbd7基因是Onodera等[21]通过动物实验发现的一种在胎儿发育期对唾液腺、肺分支形成具有重要作用的基因，可以促进上皮组织重塑和分支器官形成。杨等[22]通过检测Btbd7基因在SD乳鼠牙根不同发育阶段的表达情况，发现Btbd7基因在SD乳鼠牙根发育期间于上皮根鞘组织中高表达，并且随着上皮根鞘的成熟而逐渐减少。Btbd7基因在SD乳鼠牙根发育不同阶段的上皮根鞘中以特异性的时间-空间模式表达，从而推测Btbd7基因可能参与SD乳鼠磨牙牙根分支的发育。

3 牙根发育与牙源性干细胞的联系

研究牙根发育机制可为临床上治疗相关牙根发育异常的疾病提供治疗方法，还可为牙再生指明方向。许多实验证据表明，部分牙根发育相关信号通路可调节牙源性干细胞分化。牙根的发育模式比较特别，出生后甚至牙萌出后仍在继续，所以参与此过程的牙源性干细胞在牙再生方面必定有重要作用[23]。牙源性干细胞都具有分化的能力，目前对成牙本质分化能力研究较多的是根尖乳头干细胞SCAP、牙髓干细胞DPSC、人类脱落乳牙干细胞hSHED等，许多实验研究结果表明牙根发育机制相关信号通路可调节牙源性干细胞分化的能力。

作为由BMP2调节的转录因子，Forkhead c2（Foxc2）在成骨/牙齿发生中起主导作用，研究结果表明，Foxc2和BMP2在体外协同促进SCAP的骨/牙源性分化和矿化[24]。另外，PLLA纳米纤维微球（NF-MS）作为细胞传递载体与PLGA微球中BMP-2的控制释放对诱导SCAP牙源性分化的实验证实，BMP2可明显促进SCAP的成牙本质能力，在NF-MS模型上观察到成牙本质细胞样细胞和牙本质样组织形成[25]。BMP2与血管内皮生长因子VEGF均在牙根发育和牙本质形成中发挥重要作用，慢病毒载体介导的BMP2和VEGF基因共转染显著激活人SCAP的骨/牙源性分化[26]。以上实验均证明BMP2与SCAP分化能力密切相关。NOTCH信号在许多物种器官组织的形态发生中扮演了一个重要的角色，它促进或者抑制细胞的繁殖，启动或阻止细胞的分化，决定了干细胞分化的类型。它也被认为在牙齿发育、牙髓再生和创伤后的自我修复中起到重要作用。研究发现，正在萌出的牙齿颈环中有NOTCH3表达，NOTCH3的作用可能是保持干细胞龛中细胞的未分化状态。体外培养的SCAP表达了NOTCH3及其配体JAG1，证明NOTCH3可能在调控SCAP的特性和生物行为中发挥作用[27]。

DPSC的增殖分化潜能可观，同时许多信号通路可增强其增殖分化效力。小分子和/或重组蛋白对Wnt/Notch信号传导的短暂预处理可激活增强DPSC在培养中的干性和效力[28]。SOX2可能通过Wnt信号通路的激活和Wnt基因的上调促进DPSCs向成牙本质细胞分化[29]。氢氧化钙通过调节TNF-α影响NF-κB，p38MAPK和Wnt通路来促进的人DPSCs成骨分化[30]。而SHED可成功诱导成功能性血管平滑肌细胞从而用于血管组织工程，并且该过程可通过TGF-β-1-ALK5信号传导途径调节，这可能为血管组织工程提供新思路[31]。

在牙髓再生方面，许多体外实验证实单个或多个信号通路可诱导人DPSCs和SCAP迁移、增殖和分化，这种“干细胞归巢”的作用是实现牙髓再生的重要途径。动物和人体内实验同样实现了牙髓再生，而且于个别实验对象中观察到了神经纤维和牙本质样组织的生成。然而这些技术尚不成熟，到最终应用于人体、在临床上推广还有很长的路要走[32]。牙根发育相关信号通路精细而复杂，与牙源性干细胞的联系也有许多待探究的空间。因牙源性干细胞来源简单可靠，研究其分化的机制、与牙根发育的关联，可为如何将其有效率、低成本地应用并推广至临床提供有力的基础依据。与此同时，许多基础研究为体外研究，研究对象基本集中于动物，如何为干细胞发育提供适合的环境，研究结果能否应用于人颌骨上，这仍是一个需要解决的难题[33]。

4 结论

综上所述，牙根的发育机制虽然尚未被阐明，但越来越多的信号通路被研究发现。其中精细而复杂的联系需要我们逐个探究解开谜底。牙源性干细胞应用于牙根再生的组织工程炙手可热，“干细胞归巢”应用于牙髓再生指日可待，但技术仍不够成熟，且研究结果局限，这些难题仍有待解决。牙根的发育机制有待进一步研究，这对指导牙源性干细胞应用于牙根再生的组织工程有重要的理论和实践意义。