MicroRNA-21在非酒精性脂肪肝病中的分子机制

王秀梅，李昌平

西南医科大学附属医院消化内科，四川 泸州 646000

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种肝脏代谢失调疾病，指在没有过多的酒精摄入（典型的阈值为男性＜30 g/d，女性＜20 g/d）的情况下，出现脂肪肝、脂肪浸润加炎症，和肝细胞性气球变性[非酒精性脂肪性肝炎（NASH）][1]。大部分NAFLD患者可长时间停留在NAFL阶段，甚至经过饮食调整及适当运动或其他药物治疗可逆转至正常水平。约15%NASH易进一步发展出现肝纤维化，甚至肝硬化，而在NASH伴随有肝纤维者中，约有2.8%患者有发生肝癌的风险[1-2]。NAFLD正在迅速成为严重的全球健康问题，其流行率与肥胖和2型糖尿病的患病率迅速上升一致，且也逐渐成为肝移植的指标[3]。既往对于NAFLD的发生机制比较认同的是“二次打击学说”。随着对NAFLD的研究，发现NAFLD的发病机制复杂，有证据表明脂肪组织的功能失调、肠道微生物的失调、肌肉、胰岛素抵抗等都参与NAFLD的病理生理[4-7]，使NAFLD被视为一种系统代谢性疾病的肝脏表现[8]。NAFLD的分子机制网络目前仍不完整，仍需要进一步的研究明确。

研究表明在正常人及NAFLD中miRNAs的表达不同，其中某些miRNAs可能参与NAFLD的病理生理过程，比如：脂质代谢[9]、细胞增殖、炎症、凋亡、细胞周期失调及促进纤维化等[10]，因此miRNAs可能会是NAFLD进展中重要的调解者，并被认为可以作为NAFLD进展及严重程度的非侵入性诊断指标[11]。MircoRNA-21（MIR-21）定位于17q23[12]，是MicroRNAs中的一员，也是目前了解最多的MiRNA之一，MIR-21的表达参与NAFLD的发病及其进展，进一步明确MIR-21在NAFLD的发病过程中的作用及其分子机制对进一步理解NAFLD的病理生理及治疗非常重要。本文通过文献资料阐述MIR-21在非酒精性脂肪肝病不同发展阶段中作用及其分子机制网络，并为进一步的靶向MIR-21的药物提供依据。

1 MIR-21与非酒精性肝脂肪变性的关系

脂肪肝是NAFLD的早期阶段，脂肪肝的形成与多方面因素有关，如不良的饮食习惯、糖尿病、缺乏运动等。在脂肪肝的形成过程中，MIR-21可参与脂质平衡。但MIR-21对肝脏脂肪变性的作用在不同研究中具有差异。既往早期研究表明不饱和脂肪酸可以通过mTOR/NF-κB依赖性机制上调MIR-21的合成，而MIR-21可以靶向抑制肝细胞中磷酸酶和张力蛋白同系物（PTEN）的表达，从而引发肝脂肪变性[13]。而随后的研究却发现，高脂饮食诱导的肝脂肪变性和游离脂肪酸处理的肝细胞中miR-21的表达降低，MIR-21可以靶向抑制肝细胞中的脂肪酸结合蛋白7，因此高脂饮食及游离脂肪酸导致的MIR-21的减少使得脂肪酸结合蛋白7的表达增加，从而导致脂肪酸摄取增加，MIR-21的模拟物则能起到抑制肝脂质积累的作用[14]。在用棕榈酸和油酸处理的HepG2诱导NAFLD的体外实验中发现3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGCR）是MIR-21的直接靶标，与MIR-21的表达负相关。MIR-21可以直接靶向HMGCR的3’UTR，抑制HMGCR的表达降低游离胆固醇、总胆固醇及甘油三酯的水平，预防NAFLD的发展[15]。我国研究也表明，在高脂饮食喂养的糖尿病伴发非酒精性脂肪肝小鼠模型中MIR-21的表达降低，且随着脂肪肝的加重而进一步下调，MIR-21的表达与PPAR-α和PPAR-γ基因表达上调呈负相关，参与NAFLD的发病过程[16]。结合近期的研究表明MIR-21的表达对脂肪肝的形成具有保护作用。但本课题组2017年研究通过将miR-21mimic转染进HepG2中上调MIR-21的水平，发现其可以通过靶向抑制低密度脂蛋白相关蛋白6（LRP6）的转录及翻译，促进细胞中脂肪形成及甘油三酯、磷脂、胆固醇的分泌增加，同时诱导脂肪酶基因的表达，如：ACC1，SCD1，SREBP1，和LXRα，除了脂肪酸合成酶，MIR-21可以通过抑制LRP6的表达介导脂肪形成[17]。总之，关于MIR-21与脂肪肝的作用存在矛盾，关于MIR-21的表达及作用差异猜测可能有受到不同模型处理以及炎症的影响，需进一步针对MIR-21在单纯脂肪肝，无炎症及气球样变中进一步研究。SREBP2同时也是HMGCR的转录调节者，HMGCR是胆固醇合成的关键酶之一，LRP6及HMGCR均是MIR-21的靶标，而HMGCR在突变的LRP6携带者中表达增加[18-19]。MicroRNAs家族在调节下游靶标时主要起着微调的作用，且能同时被多个因子调节，也能调节多个下游靶标，通过目前的研究考虑MIR-21在非酒精性脂肪肝中并不是一个关键的调节因子。

2 MIR-21与NASH的关系

研究表明PPAR-α的表达在NASH的患者中是显著减少的，且与NASH的严重程度、脂肪变性的程度、胰岛素抵抗及纤维化呈负相关，与脂联素呈正相关，且PPAR-α及其靶基因（如：肉碱棕榈酰转移酶1肝同种型，成纤维细胞生长因子21和丙酮酸脱氢酶激酶同工酶4的增加与NASH的改善有关[20]，另外最近有报道PPAR-α可能会通过抑制SREBP1-C/PNPLA-3途径减轻NASH的脂质形成、炎症及细胞凋亡过程[21]。说明PPAR-α在NASH中具有重要作用。

而Loyer[22]在试验中证明PPAR-α是MIR-21的直接靶标，MIR-21可以通过抑制PPAR-α的表达，促使PPAR-α对促炎信号途径及促纤维化基因的转录抑制作用减弱，诱导肝细胞损伤、炎症及其纤维化，而不影响肝脂质累积。同时作者在试验中第1次验证MIR-21的过表达主要是在NASH患者及小鼠肝脏炎症细胞及其胆管细胞中，而沉默MIR-21后可以改善NASH，但对脂肪变性及脂肪酸β氧化无明显作用，可能与MIR-21在肝细胞中表达较少有关，结合MIR-21在非酒精性脂肪肝的作用研究，也可能与MIR-21的减少促进肝脏脂肪变性有关。Rodrigues[23]的研究也支持上诉结果，研究说明由奥贝胆酸激活的法呢酯X受体可以和MIR-21的减少一起具有协同作用，诱导PPARα改善NASH。但PPARα并不完全由单独MIR-21调节，其还可以由miR-10b和miR-34a调节参与脂质变性，因为同样由MCD饮食诱导的NAFLD，MIR-21在MCD喂养的2～8周内并没有增加，而PPARα却逐渐降低[23]。

3 MIR-21与肝纤维化及其肝癌的关系

NASH患者部分伴有肝纤维化，后续有进展为肝硬化，甚至肝癌的趋势，而肝纤维也是发生肝癌的独立风险因素。MIR-21也与肝纤维化及肝癌发生有关，主要通过以下途径发挥作用。

3.1 肝纤维

有研究表明在NASH患者及动物模型肝组织中，瘦素可以通过诱导NADPH氧化酶的亚单位P47phox与膜对应物gp91phox结合激活NADPH氧化酶产生过氧化亚硝酸盐，导致活性氧（ROS）的产生，ROS促使NF/KB核易位激活，预测是通过与MIR-21的启动子相结合诱导上调MIR-21，MIR-21通过抑制SMAD7促进SMAD2/3磷酸化，与SMAD4结合易位至核中促进靶基因的表达，促进转化生长因子β（TGF-β）信号途径，激活肝星状细胞分泌细胞外基质，造成NASH中的纤维化[24]。同时，TGF-β1可以通过激活SMAD2/3磷酸化进一步促进MIR-21的表达形成正反馈作用[25]。此外激活的肝星状细胞还可产生IL-6，其可以通过IL-6/STAT3途径激活MIR-21，因此在肝星状细胞与MIR-21之间也存在正反馈调节加剧肝纤维化[26]。

除通过TGF-β/SMAD7信号相互作用外，MIR-21还可以通过抑制下游靶基因-SPROUTY2激活细胞外信号调节激酶1信号途径激活肝星状细胞及抑制肝细胞核因子4α促进上皮间质转换，从而促进肝纤维化，而抑制MIR-21的表达可以缓解四氯化碳诱导的肝纤维化表现，且其作用不是通过减少肝细胞凋亡所致，可能是由于肝星状细胞及肝细胞生物学特征的恢复[27]。同时MIR-21可以分别通过SPRY1/ERK/NF-κB途径及SMAD2/3/NOX4途径促进NLRP3炎性体/IL-1β轴的激活进而促进肝星状细胞的激活促进肝纤维化。因此在肝纤维化过程中，MIR-21可以通过多种途径促进肝纤维化，同时也可以通过MIR-21/SPRY1/ERK正反馈通路及MIR-21/SMAD7/SMAD3/NOX/ROS正反馈通路保持MIR-21的高表达水平[28]。而上皮间质转换除了促进纤维化外，也是促发癌症侵袭及转移的关键事件，它参与肿瘤细胞极性的丢失、细胞间黏附的改变、细胞骨架重组及细胞信号途径。尽管MIR-21在肝星状细胞中高表达（8～24倍的诱导），但不管是抑制MIR-21的表达还是基因敲除MIR-21都不能抑制肝星状细胞的活化，进而阻止肝纤维化的进展，因此针对靶向MIR-21的药物可能并不能治疗肝纤维化[29]。

3.2 肝癌

MIR-21被认为是一个“oncmir”，其在肝癌中过表达，在对肝癌的研究中我们发现，由于microRNA的多靶向特性，MIR-21可以通过多种靶标参与肝癌的发生过程，如：磷酸酶和张力蛋白同源物（PTEN）、程序性细胞死亡4蛋白、逆转诱导富含半胱氨酸的伴有Kazai基序的蛋白质、Navigator-3、B细胞易位基因2、肝细胞癌下调1、HMG盒转录因子等通过不同路径参与肝癌的增殖、侵袭、转移、抑制凋亡等。同时MIR-21也可增强肝脏肿瘤干细胞的特性，如：球体形成、侵袭及转移，其可能与肝癌的复发有关。抑制MIR-21可以抑制肝癌的侵袭、转移、促进肝癌细胞的凋亡、减少肝癌复发。除以上靶标之外，通过抗miR-21处理后的全局基因表达分析揭示了近30个不同的miR-21靶基因被上调，表明在miR-21抑制后在HCC细胞中观察到的作用是多种基因表达的累积变化的结果，而不是miR-21的单个直接靶标[30-35]。而除了促进癌症的发生外，最近发现MIR-21对于抗癌作用也是需要的，MIR-21可能会通过PTEN/Akt途径调节CD4+、CD8+T细胞的活性发挥免疫作用抵抗肿瘤的发生，其具有双向作用[36]，但就其整体作用，MIR-21的促癌作用可能大于其抑癌作用。而同样的减少MIR-21的表达不会阻止肝癌的发展。

4 总结

随着对MIR-21在NAFLD的作用及其相关机制的不断研究，作为一种miRNAs，MIR-21在NAFLD的发病过程中起着比较重要的作用，通过复杂的分子机制网络参与脂质形成，促进炎症、纤维化及肝癌的发生发展，但是MIR-21在脂肪肝中可能并不是主要的调节因子，同时靶向MIR-21药物单独的治疗NAFLD结果并不令人满意，其不能阻止肝纤维化及肝癌的发展，在肝纤维化的过程中，部分学者认为，MIR-21在肝星状细胞激活及维持活化状态只是为了促进生物过程的稳健性，而不是作为主要调节者来控制生物过程[37]。但抑制MIR-21的表达可以减少炎症，治疗NASH，同时还可以联合其他药物加强疗效。未来期望可以联合其他药物通过多种机制治疗NAFLD。