近红外光谱法快速定量检测青烟叶及烤烟叶中的生物碱

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(1. 上海烟草集团有限责任公司技术中心， 上海200082； 2. 上海大学环境与化学工程学院， 上海200444)

生物碱是烟草品质的最重要化学指标，主要包括尼古丁以及其他微量生物碱，如降烟碱、新烟草碱和假木贼碱等。烟草生物碱的含量与组成将直接影响烟草的抽吸特征及质量安全[1]，是影响烟叶品质的重要因素。尼古丁含量是评价烟叶品质的决定性因素，约占烟草生物碱总量的95%(质量分数，以下同)以上[2]， 是烟草化学常规检测的重要指标之一。 烟草中微量生物碱的含量与卷烟质量安全息息相关，一般要求其含量小于烟草生物碱总量的6%[3]。在烟草调制中， 降烟碱、 假木贼碱和新烟草碱可转化成烟草特有亚硝胺(TSNA)[2]， TSNA被认为是卷烟中活性最强、 含量最大的致癌成分， 严重危害卷烟质量安全。 烟草植株中， 个别植株由于基因突变会形成烟碱转化基因， 具备了烟碱去甲基能力， 因此导致尼古丁含量减小， 降烟碱含量显著增大， 这一类降烟碱含量大于生物碱总量5%的植株被称为转化株[4]。 转化株降烟碱含量过大， 会严重影响卷烟品质和质量安全， 在烟草生产活动中需要加以辨别和清除。 快速、 准确、 定量检测烟草中生物碱含量与组成，对烟叶质量评价、 提升卷烟质量安全具有重要意义。

近红外光谱(NIR)技术具有无损、快速、准确的优点，已经被广泛应用于我国烟草行业[5]。目前近红外在烟草中的应用研究主要针对烤后烟叶的常规检测指标，较少针对烤前青烟叶及其他微量指标[6-10]。 本文中应用傅里叶变换近红外漫反射光谱(FT-NIR)技术， 建立青烟叶及烤烟叶中4种生物碱(尼古丁、 降烟碱、 新烟草碱、 假木贼碱)的近红外数学定量模型， 实现对烟草中微量生物碱的准确、 快速定量检测； 分别对比转化株及非转化株烤前青烟叶及烤烟叶样品的4种生物碱含量， 分析转化株烟叶烘烤调制过程中的烟碱转化， 有助于研究烟草生物碱的代谢与转化途径， 可辅助深入研究其转化代谢机理， 为烟草生长过程中烟叶品质的调控提供指导。

1 实验

1.1 仪器及软件

近红外光谱仪型号为AntarisⅡFT-NIR，配备积分球漫反射采样系统，Thermo Fisher公司生产。

近红外光谱数据处理软件为OMNIC，光谱分析化学计量学建模软件为TQ Analyst。

1.2 样品

青烟叶样品123份，青烟叶采摘后经干冰冷冻方式运输后，在液氮下粉碎、磨粉、整理，于-80 ℃超低温冰箱中保存以备用。测试前，需要将样品取出放于干燥皿中，静置24 h至室温，然后进行近红外光谱扫描。

烤烟叶样品412份，其中包含123份青烟叶的对应烤后样品。

1.3 光谱采集

环境温度为20～24 ℃，相对湿度为55%～65%，近红外光谱扫描范围为4 000～10 000 cm-1，分辨率为8 cm-1，扫描64次，取平均值。

1.4 样品化学值测量

采用气相色谱- 氢火焰离子化检测器(GC - FID)的方法进行4种生物碱化学值的定量检测。

1)配置工作曲线进行外标法定量，对烟草样品碱化处理后用甲叔醚溶液过夜萃取，然后进行分析。

2)GC - FID条件。细管柱，DB - 5(30 m×0.32 mm×1 μm)； 进样量为1 μL，不分流进样；进样口温度为250 ℃；载气为He，恒流，体积流量为1.7 mL/min；程序升温：110 ℃下保持5 min，然后以10 ℃/min的速率升至185 ℃，再以6 ℃/min的速率升至250 ℃保持10 min；FID检测器温度为300 ℃。

2 结果与讨论

2.1 光谱处理

基于青烟叶样品及烤烟叶样品的化学实测值与近红外光谱数据进行建模及验证，对近红外光谱进行一阶导数处理，Norris平滑(段长5，段间距5)，采用偏最小二乘(PLS)法建立4种生物碱化学含量与近红外光谱的数学模型，并进行验证。

2.2 模型评价

考察所建模型校正集与验证集的相关系数r，以交叉验证均方差(RMSECV)、预测均方差(SEP)和校正均方差(SEC)的比值、验证集标准偏差(SD)与SEP的比值作为评价模型优劣的指标，当r大于0.9，SEP与SEC的比值介于0.8～1.2，SD与SEP的比值大于2.0时，所建模型预测效果较好[11]。

2.3 异常值剔除

1)通过残差分析剔除化学值与预测值差别较大的样品，即离群值[12]；

2)通过学生化残差(残差与相对标准偏差的比值)分析，剔除化学值异常的样品。

2.4 近红外定量分析模型的建立与验证

2.4.1 尼古丁

分别建立青烟叶、烤烟叶样品的尼古丁含量与近红外光谱的定量分析模型，青烟叶建模106个样品，独立验证11个样品，剔除6个异常值，交叉验证预测27个样品；烤烟叶建模373个样品，独立验证37个样品，剔除2个异常值，交叉验证预测187个样品。校正集及验证集的r、RMSECV、SEP与SEC的比值、SD与SEP的比值以及含量范围如表1所示，尼古丁含量预测值与实测值的散点图见图1。

表1 青烟叶及烤烟叶中尼古丁含量近红外数学模型评价结果

(a)青烟叶(b)烤烟叶图1 青烟叶、烤烟叶中尼古丁含量预测值与实测值散点图

2.4.2 降烟碱

分别建立青烟叶、 烤烟叶样品的降烟碱含量与近红外光谱的定量分析模型， 青烟叶建模101个样品， 独立验证14个样品， 剔除8个异常值， 交叉验证预测26个样品； 烤烟叶建模352个样品， 预测37个样品， 剔除23个异常值， 交叉验证预测192个样品。 校正集及验证集的r、 RMSECV、 SEP与SEC的比值、 SD与SEP的比值以及含量范围如表2所示， 降烟碱含量预测值与实测值的散点图见图2。

表2 青烟叶及烤烟叶中降烟碱含量近红外数学模型评价结果

(a)青烟叶(b)烤烟叶图2 青烟叶、烤烟叶中降烟碱预测值与实测值散点图

由图2可以看出， 青烟叶及烤烟叶样品中， 降烟碱含量高的样品数量较少， 绝大多数样品的降烟碱含量落在图中较低水平且分布相对集中。 在模型建立过程中， 少数高含量样品的存在会使模型强制过高点， 使模型发生偏离， 导致低含量样本的预测值偏离化学值， 影响所建模型的准确性。考虑到烟草种植的实际情况以及日常检测样品的含量区间范围， 去掉样品中的转化株样品进行二次建模， 可以根据实测情况应用不同的降烟碱模型对降烟碱含量进行预测， 以提高预测准确性。 非转化株样品所建模型的评价结果及散点图如表3和图3所示。

表3 青烟叶及烤烟叶中降烟碱近红外数学模型评价结果(非转化株)

(a)青烟叶(b)烤烟叶图3 青烟叶、烤烟叶中降烟碱含量预测值与实测值散点图(非转化株)

由表3、图3中数据可以看出，去掉转化株样品后所建模型，青烟叶及烤烟叶数据模型各评价指标变化不大，r值仍在0.90～0.95附近，且主因子数减小至10、6，SEP与SEC的比值为0.84、0.97，SD与SEP的比值均大于2.0，模型各项评价指标均较好。在日常检测中，针对非转化株样品，可应用本模型进行预测，以提高预测准确性。

2.4.3 新烟草碱

分别建立青烟叶、 烤烟叶样品的新烟草碱含量与近红外光谱的定量分析模型， 青烟叶建模112个样品， 预测7个样品， 剔除4个异常值， 交叉验证预测28个样品； 烤烟叶建模366个样品，预测38个样品， 剔除8个异常值， 交叉验证预测182个样品。 校正集及验证集的r、 RMSECV、 SEP与SEC的比值、 SD与SEP的比值以及含量范围如表4所示， 新烟草碱含量预测值与实测值的散点图见图4。

2.4.4 假木贼碱

分别建立青烟叶、 烤烟叶样品的假木贼碱含量与近红外光谱的定量分析模型， 青烟叶建模109个样品， 预测8个样品， 剔除6个异常值， 交叉验证预测28个样品； 烤烟叶建模366个样品， 预测37个样品， 剔除9个异常值， 交叉验证预测178个样品。 校正集及验证集的r、 RMSECV、 SEP与SEC的比值、 SD与SEP的比值以及含量范围如表5所示， 假木贼碱含量预测值与实测值的散点图见图5。

2.5 青烟叶及烤烟叶生物碱含量分析

经过2.4.2节中对降烟碱含量的考察结果可知，在本批样品中包含部分转化株烟草样品，为了进一步研究转化株及非转化株样品烘烤调制前、后生物碱含量的变化，选取青烟叶及烤烟叶样品中样品植株信息相对应的样品共83份，进行烤前、烤后生物碱含量的分析。以同一样品烤后含量与烤前含量比值来表征烘烤调制过程生物碱含量的变化(见表6)。

表4 青烟叶及烤烟叶中新烟草碱含量近红外数学模型评价结果

(a)青烟叶(b)烤烟叶图4 青烟叶、烤烟叶中新烟草碱含量预测值与实测值散点图

表5 青烟叶及烤烟叶中假木贼碱含量近红外数学模型评价结果

(a)青烟叶(b)烤烟叶图5 青烟叶、烤烟叶中假木贼碱含量预测值与实测值散点图

表6 烟叶烘烤调制前、后生物碱含量的变化

由表6中可以看出，正常烟草非转化植株，烘烤调制前、 后4种生物碱的含量基本不变。转化株烘烤调制前、后新烟草碱、假木贼碱含量变化不大，尼古丁含量明显减小，降烟碱含量显著增大，这表明转化株在烘烤调制过程中发生了尼古丁向降烟碱转化的过程，从而导致尼古丁含量减小，降烟碱含量增大，与文献[3]报道一致。这种转化过程发生的原因如下：转化株中含有烟碱转化基因，可生成数量较多的高活性烟碱去甲基化酶，在烘烤调制初始阶段，酶活性的提高促使了尼古丁向降烟碱的转化。

3 结论

1)青烟叶及烤烟叶样品的近红外数学模型各项评价指标较好，预测值与实测值的r约为0.9，预测均方差与校正均方差比值均为0.8～1.2，验证集标准偏差与预测均方差比值均大于2.0，表明所建近红外预测模型准确、可靠，近红外光谱技术可用于各类生物碱，包括微量生物碱的快速定量检测。

2)正常非转化株烘烤调制前、后4种生物碱含量变化不大，转化株烘烤调制后尼古丁含量有所减小，降烟碱含量显著增大，表明烟叶在烘烤调制阶段发生了尼古丁转化生成降烟碱的过程。