不同离心方法提取及鉴定精浆外泌体的效果比较

郭文彬，张万松，杨 诚，卞 军，杨建昆，刘存东，亓 涛，王春艳

0 引 言

外泌体是一种能被机体内大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜，直径大约 30～150nm［1⁃4］。外泌体不仅存在细胞上清液中，同时也广泛存在并分布于各种体液包括血液、眼泪、尿液、唾液、乳汁、腹水［5⁃6］。外泌体富含多种蛋白质、脂类、DNA和RNA等重要信息且易与毗邻的细胞膜发生融合并将其活性内容物释放到受体细胞［5，7］，以直接或间接的方式影响细胞的生理状态并与多种疾病的发生发展［7］。正常人精浆是由精子和精浆组成，精浆占精浆占绝大部分的一种黏稠的液体混合物，对生殖有着决定性意义。

目前我们对精浆来源的外泌体研究尚处于初级阶段，特别是在男性不育方面，外泌体在生殖过程中精子成熟、顶体反应、精卵融合等方面研究较少，及其重要功能作用和机制研究尚不清楚［8］。从成分复杂的生物液体中如何高效率获得高产量、高浓度、高纯度，并保留其生物学特性的外泌体，是目前的难点，这与外泌体分离提取方法的选择密切相关。有报道聚乙二醇成功应用于血清，肾上皮细胞，角质细胞等多种人源细胞［9］及干细胞外泌体的提取［10］。本研究前期实验亦采用的是聚乙二醇富集精浆来源的外泌体［11］。外泌体的提取方法多样，超速离心法、ExoPerfectTM⁃MU法与PEG6000法比较提取外泌体在细胞上清［12］和其他的体液中都有成功的报道［13］，而3种方法比较提取精浆外泌体的应用报道较少。本研究比较及鉴定超速离心法、Exo⁃PerfectTM⁃MU法及PEG6000法提取的精浆外泌体，为外泌体的研究提供不同的选择方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2017年3月至7月南方医科大学南方医院检验中心30例正常志愿者的精浆样本。纳入标准：均符合WHO第5版诊断标准［14］；年龄27～38岁；禁欲天数3～5d。排除标准：样本液化时间、pH、精子形态、精浆果糖、酸性磷酸酶、α葡萄糖苷酶等参数异常。精浆样本随机平均分成3份。本研究经过医院伦理委员会批准（批准号：2018⁃0315），所有志愿者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器及试剂SCA精子质量分析仪（Mi⁃croPtic，西班牙），智能超速离心机（Beckman，美国）；纳米颗粒跟踪分析仪（NanoSight，英国）；透射电子显微镜（Hitachi，日本）；PEG6000（Sangon，上海）；0.45 μm 和 0.22 μm（Millipore，美国）；电泳仪和电转仪（Bio⁃Rad，美国），总蛋白提取试剂盒（Beyotime，上海），蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，上海），蛋白浓度测定试剂盒（Thermo⁃Pierce，上海），兔抗人CD63、TSG101多克隆抗体（abconal，美国），兔抗人Calnex⁃in多克隆抗体（Bioworld，美国），HRP标记羊抗兔IgG（Ray Antibody，北京），PVDF膜（BioTrace，墨西哥）。

1.3 方法

1.3.1 分离精浆采用SCA精子质量分析仪分析液化后的精浆样本，按前向运动精子率（progressive motility，PR）取其正常指数的临床样本。精浆样本室温液化20 min，转移无菌EP管进行低温4℃，1000×g离心15min去除精子细胞，4℃，12 000×g离心30 min去除小细胞及碎片，取上层精浆待用或-80℃保存备用。

1.3.2 精浆外泌体的分离和提取①PEG6000法：取制备上层精浆2mL，按1∶1与PBS混匀后经0.45、0.22 μm滤膜进行滤过，去除粒径较大的微囊泡，再用 PEG6000 2 ×（16 g PEG6000，5.844 g Nacl溶于100 mL ddH2O）按1∶1充分混合4℃过夜（终浓度为8%PEG6000）。次日取混合液进行4℃，12 000×g离心30 min，取沉淀用PBS重悬混匀，采用低温超高速离心机100 000×g离心90 min获取沉淀，经过滤的PBS 200μL重悬提取物后，0.22 μm滤膜过滤除菌，-80℃保存备用；待用时，BCA法定量外泌体的总蛋白。②超速速离心法：取经0.45、0.22 μm滤膜进行滤过上层精浆2mL，PBS重悬混匀，采用低温超高速离心机100 000×g离心70 min获取沉淀，经过滤的PBS重悬提取物，再次经低温超高速离心机100 000×g离心70 min获取沉淀，经过滤的PBS 200μL 重悬提取物后，0.22 μm滤膜过滤除菌，待用时，BCA法定量外泌体的总蛋白。-80℃保存备用。③ExoPerfectTM⁃MU法：取2mL制备好的精浆至无菌EP管，加入ExoPerfectTM⁃MU exosome分离纯化溶液0.4mL，充分混匀后4℃过夜。次日，低温4℃，1500×g离心30 min，去除残余溶液，200 μL经过滤的PBS重悬混匀exosome沉淀，待用或-80℃保存备用。

1.3.3 透射电镜法取20～40 μL精浆外泌体沉淀悬液于载样铜网上，室温静置5 min，用滤纸从侧面吸干液体滴加pH=7.0，4%磷钨酸溶液约10 μL于铜网上，室温负染5 min。滤纸吸干负染液，白炽灯下烤干约15 min，负染15 min置于透射电子显微镜下观察外泌体形态并拍照。

1.3.4 Western blot法取外泌体悬液添加上样缓冲液，95℃，变性10 min，每个上样孔添加40 μg样品10%SDS⁃PAGE凝胶电泳（80 V，30 min；100 V，60 min）分离蛋白，湿法（200 mA，120 min）转印至PVDF膜，用含5%牛血清白蛋白的TBS液室温封闭1 h；一抗兔抗人CD63、TSG101 多克隆抗体1∶1000、兔抗人Calnexin多克隆抗体1∶1000分别置于4℃过夜，TBST液洗膜3次，10 min/次，二抗兔抗羊IgG 1∶10 000室温孵育1 h，TBST液洗膜3次，10 min/次，ECL发光试剂盒显影，Bio⁃Rad凝胶成像系统获取图像。

1.3.5 纳米颗粒跟踪分析取精浆外泌体，经0.22 μm滤嘴过滤的无菌水按1∶2500稀释成1 mL，通过纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）进行测量分析，计算出精浆外泌体的粒径和浓度。

1.4 统计学分析采用GraphPad Prism 7统计软件进行分析。计量数据采用均数和标准差（xˉ±s）表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时用LSD⁃t检验，方差不齐时用Dunnett⁃t检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本资料3种离心方法精浆基本参数差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 正常志愿者精浆基本参数（±s，n=10）Table1 Demographic data and semen parameters of the healthy donors in three different groups（±s，n=10）

表1 正常志愿者精浆基本参数（±s，n=10）Table1 Demographic data and semen parameters of the healthy donors in three different groups（±s，n=10）

变量 超速离心法ExoPerfectTM⁃MU法PEG6000法pH值体积(mL)形态正常精子率（%）前精子浓度（mol/L）PR(%)7.57±0.04 4.17±1.05 10.6±1.07 115.0±43.89 42.16±3.75 7.71±1.04 3.87±1.76 11.6±0.18 121.0±50.38 52.16±3.06 7.49±0.89 4.04±1.83 9.6±0.91 109.0±34.89 47.16±1.97

2.2 透射电子显微镜结果透射电子显微镜下观察到3种方法提取的精浆外泌体呈圆形、椭圆形的囊泡，有完整双层膜包绕，直径约在30～150 nm之间，内部含有低电子密度物质。见图1。

图1 电镜下3种方法提取的精浆外泌体形态Figure 1 Morphology of the seminal plasma exosomes ex⁃tracted by three different methods

2.3 Western blot结果超速离心法、ExoPerfectTM⁃MU法及PEG6000法提取的精浆外泌体均阳性表达CD63、TSG101蛋白，对应的精子细胞和提取后的精浆上清成阴性。同时，Calnexin蛋白仅表达精子细胞，精浆外泌体和提取后精浆上清均成阴性。超速离心法外泌体中CD63、TSG101含量最多，其次分别是 ExoPerfectTM⁃MU 法 、PEG6000 法（P＜0.05）。见图2。

图2 3种方法提取精浆外泌体的标志物及含量比较Figure 2 Marker protein level and expression of the semi⁃nal plasma exosomes extracted by three differ⁃ent methods

2.4 NTA结果超速离心 、ExoPerfectTM⁃MU及8%PEG6000对精浆来源提取物经过滤PBS稀释2500倍后，结果提示MODE曲线线性流畅，外泌体直径大小较为集中；粒径峰值平均值分别为105、102 、115 nm，差 异 无 统 计 学 意 义（P＞0.05）。PEG6000法提取精浆外泌体的浓度、电镜下数量较超速离心法、ExoPerfectTM⁃MU法均明显降低（P＜0.01），ExoPerfectTM⁃MU法离心时间较超速离心法、PEG6000法明显缩短（P＜0.001）。见表2。

表2 正常志愿者3种方法提取精浆外泌体的浓度比较（±s）Table 2 Concentration,number and centrifugation time of the seminal plasma exosomes extracted by three different methods（±s）

表2 正常志愿者3种方法提取精浆外泌体的浓度比较（±s）Table 2 Concentration,number and centrifugation time of the seminal plasma exosomes extracted by three different methods（±s）

与 PEG6000 法比较，*P＜0.05、**P＜0.01；与 ExoPerfectTM⁃MU 法比较，＃P＜0.001

方法超速离心法ExoPerfectTM⁃MU法PEG6000法n 10 10 10浓度(×108/mL)21.20±0.98**19.74±1.45**11.90±1.78电镜下数量（n）7.0±1.63*6.0±1.63*4.7±1.7离心时间（min）140±20＃30±5 120±10＃

3 讨 论

近些年不同领域对外泌体的研究越来越多，以其表面独特的 CD63、ALIX、TSG101 等［6，15⁃17］作为外泌体的存在标志物。因此，本研究采用Western blot法验证外泌体标志物，并比较超速离心法，ExoPer⁃fectTM⁃MU法及PEG6000法外泌体中CD63、TSG101含量。

据报导，人精浆中也存在纳米级的囊泡，前人称之为前列腺小体［18］，后提出精浆来源的微囊泡称之为精浆外泌体［19⁃20］。最新研究表明，人精浆外泌体对弱精子症中的作用机制［21］及其携带的非编码小RNA有潜在的调控作用［4］。同时与正常人的对比中发现，男性少弱精子症不育患者精浆中的细胞外囊泡存microRNA差异表达谱［22］。本研究前期研究表明，不同正常男性精浆外泌体中存在共同蛋白表达谱，如ACTB、PHGDH、SEMG1、LGALS3BP 等蛋白，并在临床样本中证实［23］。为本研究开拓了新思路［24］，也为疾病的发生发展相关机制提供新方向［22⁃23］。

外泌体的提取、纯化方法各异，如何能高效的提取外泌体，仍是研究者面临的一大难题。目前国内外对外泌体的提取、纯化方法各异且在提取流程，提取纯度及背景效率都有各自的优缺点，如何根据实验所需选择快速高效率的提取方法已然成为对外泌体进一步研究的基础。因此本研究对多个临床样本分别用超速离心法，ExoPerfectTM⁃MU法及PEG6000法提取的精浆外泌体，并对其进行鉴定及产量浓度，形态大小及离心时间进行比较。本研究结果表明，3种方法所提取精浆外泌体的Wester blot均能检测到其标志蛋白CD63、TSG101的存在，且不表达精子细胞内质网Calnexin蛋白。本研究采用纳米颗粒跟踪分析仪分析其大小和透射电子显微镜观察其形态背景，发现都能得到外泌体，均能看到有双层膜结构且粒径大小30～150nm，说明3种方法都能成功提取的一定量的外泌体。本研究根据Western blot检测到的蛋白及NTA分析得出：①外泌体产量浓度上：在相同量的情况下，传统的超速离心法最多，其次ExoPerfectTM⁃MU法，PEG6000法则最少；②电镜背景方面：均能明显看得到外泌体的形态结构，对电镜下随机去5个视野进行计数分析可得：超速离心法和ExoPerfectTM⁃MU法无差别，且比PEG6000法多；③粒镜大小方面：3种方法差异无统计学意义。超速离心法提取程序多，总耗时长；ExoPerfectTM⁃MU法操作简便，用时少；PEG6000法提取因聚乙二醇是亲水性极强的聚合物，其良好的水溶性使它能和多种有机物成分具有相溶性，与生物大分子能以脱水或氢键方式相互作用形成复合物沉淀。其本身是一种化学物质，富集提取过程是否会对外泌体本身生物学功能产生影响则有待深究。

综上所述，超速离心法、ExoPerfectTM⁃MU法、PEG6000法均成功提取及鉴定精浆外泌体。超速离心法、ExoPerfectTM⁃MU法较PEG6000法外泌体的产量较多。在流程和耗时上，ExoPerfectTM⁃MU法较超速离心法、PEG6000法简捷方便。根据不同试验的实际需要，选择合适高效的外泌体提取方法尤为重要。本研究对精浆外泌体的提取提供了方法学上的选择，为精浆外泌体生物学功能和机制研究奠定了基础。