瓜蒌薤白半夏胶囊提取工艺的优化

黄 涵， 王宇卿

（南阳医学高等专科学校，河南南阳 473061）

瓜蒌薤白半夏汤源自张仲景 《金匮要略》，由瓜蒌、薤白、半夏组成，具有宣痹通阳、除痰散结、行气止痛之功效，临床上广泛用于治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死、高脂血症等心血管疾病[1-3］，疗效确切。该方以汤剂入药，但携带不便，口感不佳，而且熬制过程繁复，故本实验拟将其开发为稳定性高、服用与携带方便的胶囊剂。目前，关于瓜蒌薤白半夏汤方的研究主要集中在药理活性方面，而鲜有其提取工艺的报道，故确定该方合理的提取工艺对保证其相关制剂质量和临床疗效具有重要意义。

研究表明，瓜蒌薤白半夏汤中的主要活性成分腺苷具有促进血管扩张、降低血压的作用[4-5］，鸟苷具有舒张主动脉血管的作用[6］，薤白皂苷具有抗血小板凝聚、降脂的作用[7-8］，这些成分的药理活性与该方主要药效相吻合，故可作为提取工艺中的重要指标成分。

Box-Behnken响应面法是一种优化工艺条件的有效方法，它采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，具有试验次数少、周期短、回归方程精度高等特点，而且能研究几种因素间的交互作用，相比常用的均匀设计和正交设计显示出明显优势[9-11］。因此，本实验以腺苷、鸟苷、总皂苷提取量和干膏得率为评价指标，在遵循古方 “白酒同煮，可通阳宣痹，轻扬善行以助药势”的前提下确定药材提取溶剂为乙醇，并通过Box-behnken响应面法优化瓜蒌薤白半夏胶囊提取工艺，为其今后开发和利用提供基础。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260高效液相色谱仪，配置真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、OPENLAB CDS工作站 （美国安捷伦公司）；TU-1901紫外-可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限责任公司）；XS105DU电子分析天平 （瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-Q超纯水机 （美国Millipore公司）；XMTD-6000恒温水浴锅 （上海宜昌仪器纱筛厂）；TT6-5电热鼓风干燥箱 （上海博讯实业有限公司）；TGL-16G高速冷冻离心机 （上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试药 瓜蒌 （批号161101）、薤白 （批号161101）、清半夏 （批号161001）饮片均购自南阳仲景百信医药科技有限公司，经课题组专家鉴定符合2015版 《中国药典》各项要求。腺苷对照品 （西安舟鼎国生物技术有限公司，批号DH008-3）；鸟苷 （批号 AJ0609NA14）、薯蓣皂苷 （批号P20J7F18116）对照品 （上海源叶生物科技有限公司）。甲醇为色谱纯；磷酸、高氯酸、冰醋酸、无水乙醇为分析纯。

2 方法与结果

2.1 腺苷、鸟苷含有量测定

2.1.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流动相甲醇（A） -0.05% 磷酸（B）， 梯度洗脱（0～10 min， 5% ～12%A； 10～15 min， 12% ～30%A）；检测波长260 nm；体积流量1.0 mL／min；柱温35℃；进样量20 μL。HPLC色谱图见图1。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取对照品腺苷10.30 mg、鸟苷10.33 mg，置于25 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

图1 各成分HPLC色谱图

2.1.3 供试品溶液制备 精密量取29份响应面试验样品溶液各10 mL，置于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加水溶解并转移至10 mL量瓶中定容，摇匀，12 000 r／min离心，上清液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.1.4 阴性对照溶液制备 以响应面试验样品提取溶剂为空白溶剂，按 “2.1.3”项下方法制备，即得。

2.1.5 线性关系考察 精密量取适量腺苷、鸟苷对照品溶液混合，逐级稀释，加水定容，制成分别含腺苷103.00、49.44、 20.60、 10.30、 2.06 μg／mL， 鸟苷 61.98、 24.79、12.40、 6.20、 1.24 μg／mL的溶液， 在 “2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以质量浓度为横坐标 （X），峰面积为纵坐标 （Y）进行回归，得回归方程分别为腺苷Y＝63.198X+6.697 9 （R2＝1）， 线性范围2.06～103.00 μg／mL； 鸟苷Y＝49.374X-1.088 （R2＝1）， 线性范围 1.24～61.98 μg／mL。

2.1.6 精密度试验 精密吸取对照品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下进样测定6次，测得腺苷、鸟苷峰面积RSD分别为0.73%、0.87%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液20 μL，于0、2、4、8、12、24 h在 “2.1.1” 项色谱条件下进样测定，测得腺苷、鸟苷峰面积RSD分别为1.77%、1.51%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.8 重复性试验 精密吸取6份供试品溶液，每份20 μL，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定，测得腺苷、鸟苷含有量RSD分别为1.72%、1.17%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 取含有量已知的供试品溶液6份，精密加入适量对照品，在 “2.1.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，腺苷、鸟苷平均加样回收率分别为96.31%、95.11%，RSD分别为1.97%、1.44%。

2.2 总皂苷含有量测定[12-13］

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取薯蓣皂苷对照品13.28 mg，置于100 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

表1 因素水平

2.2.2 供试品溶液制备 精密量取29份响应面试验样品溶液各10 mL，置于蒸发皿中，水浴蒸干，残渣加水溶解并转移至10 mL量瓶中，再加水稀释至刻度，摇匀。精密量取5 mL，置于分液漏斗中，加10 mL水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 最大吸收波长确定 精密吸取薯蓣皂苷对照品溶液0.4 mL，置于具塞试管中，80℃水浴挥干溶剂，加入5%香草醛试液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀，70℃水浴加热15 min，取出，冷却至室温，冰浴放置15 min后加4 mL冰醋酸，摇匀，采用紫外-可见分光光度计在400～700 nm波长范围内扫描。结果，供试品、对照品溶液在540 nm波长处有最大吸收，而空白对照溶液在该处无吸收，故选择其作为最大吸收波长。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于具塞刻度试管中，80℃水浴挥干溶剂，加入5%香草醛试液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，摇匀，70℃水浴加热15 min，取出，冷却至室温，冰浴放置15 min后加4 mL冰醋酸，摇匀；另精密量取0.4 mL甲醇同法操作，作为空白对照，在540 nm波长处测定吸光度 （A），以其对溶液质量浓度 （X）进行回归，得方程为A＝0.024 8X+0.002 7 （R2＝0.999 7）， 线性范围 10.62～31.87 μg／mL。

2.3 干膏得率测定[14］精密吸取提取液10 mL，置于干燥至恒定质量的蒸发皿中，水浴蒸干后105℃下干燥3 h以上，置于干燥器中冷却30 min，迅速精密称定质量直至恒定，计算干膏得率。

2.4 工艺优化 在单因素试验基础上，考察乙醇体积分数（A）、提取时间 （B）、液料比 （C）、提取次数 （D） 对腺苷、鸟苷、总皂苷提取量和干膏得率的影响，Box-Behnken响应面法优化提取工艺。因素水平见表1。

以腺苷、鸟苷、总皂苷提取量和干膏得率的总评 “归一值” （OD值） （Y） 为评价指标，通过Hassan法[15］对各指标进行归一化处理，计算公式为di＝ （Yi-Ymin）／（Ymax-Ymin），其中Yi为实测值，Ymax、Ymin分别为各指标在不同试验中的最大值、 最小值； OD＝ （d1d2……dk）1／n， 其中 n为所选取的指标数。结果见表2。

通过Design Expert 8.0.5.b软件对表2数据进行多元线性回归拟合，得到方程为Y＝-7.183 91+0.040 665A+0.799 53B+1.146 47C-0.214 21D+2.793 33×10-4AB-8.041 67×10-4AC+2.316 67×10-3AD-0.019 425BC+0.348 75BD+0.054 425CD-4.682 37×10-4A2-0.675 36B2-0.050 941C2-0.191 88D2，决定系数R2＝0.954 3，表明模型拟合度良好，OD值变化有95.43%来源于所选自变量。方差分析见表3。

表2 试验设计及结果

表3 方差分析

由表可知，一次项 （A、C、D）、交叉项 （BD、CD）、平方项 （A2、B2、C2、D2）均对 OD值有显著影响 （P＜0.05）；模型P＜0.000 1，表明模型极显著；失拟项 P＞0.05，表明方程在整个回归区域拟合情况良好，可用于预测试验结果，响应面分析见图2，可知最优提取工艺为12倍量43%乙醇提取2次，每次74 min。在此优化工艺下进行3批验证试验，测得平均 OD值为 0.769 1（RSD＝1.18%）与预测值0.752 8相当，表明模型稳定性理想，工艺重复性良好。

图2 各因素响应面图

3 讨论与结论

中药成分复杂，活性成分较多，对于多味药材提取工艺而言，只有兼顾多指标进行评价才能反映整体疗效。由于多指标评价采用打分制时存在一定主观性，故本实验对其进行归一化处理，以腺苷、鸟苷、总皂苷提取量和干膏得率的总评 “归一值” （OD值）为评价指标，通过Box-Behnken响应面法优化瓜蒌薤白半夏胶囊提取工艺，能直观地反映整体工艺。

结果表明，瓜蒌薤白半夏胶囊最优提取工艺为12倍量43%乙醇提取2次，每次74 min，所得OD值与预测值相当，表明该方法科学合理，工艺稳定可靠，可为保证该制剂质量水平和临床疗效提供依据。