羊水细胞原位培养及核型制备方法的改进

郑 静，卓 越，刘艳妮

0 引 言

自1966年Steele等［1］首次报道将羊水染色体核型分析应用于胎儿染色体疾病的产前诊断以来，其仍是产前诊断染色体疾病的金标准。但由于羊水培养的影响因素较多成功率较低，国内的各大实验室都根据自己的现有条件建立了一套适合自己的培养方法。地理气候条件对其成功率影响较大，因此建立一套全国通用的培养方法和条件非常有必要。本室自2012年开始摸索羊水采集、培养、收获、制片步骤的条件，至今形成了一套羊水染色体核型制作的流程，现将其报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料2012年1月至2017年12月滨州医学院附属医院就诊的孕15～22+6周单活胎妊娠孕妇435例，孕妇年龄21～34岁，平均（26.45±3.62）岁。孕妇均有羊膜腔穿刺的指征，包括：单纯高龄（年龄≥35岁）；血清学产前筛查高风险（21-三体≥1/270、18-三体≥1/350）；无创DNA产前检测（21、18、13号染色体）阳性结果的孕妇；不良妊娠史（反复胚停、多次自然流产、生育过畸形儿、智障儿以及唐氏儿）；超声发现胎儿发育异常；近亲结婚；夫妇患病、染色体异常；不良接触史等。排除标准：先兆流产患者；体温高于37.4℃；有出血倾向（血小板≤70×109/L，凝血功能检查异常）；有盆腔或宫腔感染征象。本研究由滨州医学院附属医院伦理委员会批准（伦理批准号为：伦研批第2018-026-01号），所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 羊水标本采集 常规羊水抽取方法采集羊水标本。注意采集前医生双手摇晃孕妇腹部，便于胎儿脱落的细胞悬浮。在B超介导下用9号腰椎穿刺针经腹壁行羊膜腔穿刺，弃去最初抽取的1～2 mL羊水，另换注射器抽取羊水20～30 mL。羊水中如有明显血性羊水，立即在羊水中加入0.5 mL无菌肝素。

1.2.2 羊水细胞培养 每份羊水对应接种2个培养瓶和1个培养皿。将羊水平均加入4支10 mL离心管内，950 r/min离心10 min，弃上清留1 mL细胞层。羊水离心后根据沉淀物颜色和体积分为5～10 mm3白色细胞团块，5～10 mm3棕色团块，10～15 mm3棕色团块，5～10 mm3鲜红色团块，10～15 mm3鲜红色团块组，吸管打匀沉淀后合并至1支离心管中，Fancon 25 mL一次性带滤膜的培养瓶内预加入2.5 mL GIBCO Amnio-Max培养液，再加入1.5 mL上述细胞悬液。将载玻片放入Φ3cm的Fancon培养皿内，预加入2.5 mL培养液，再加入剩余的1 mL细胞悬液。5%CO2培养箱内37℃半开放式培养。接种6 d后开始观察，7 d换液。一般8 d收获，但应根据细胞生长状况适当调整收获时间。于终止前4 h加入秋水仙素，终浓度为20µg/mL。继续培养4 h。

选取没有任何出血、状态良好的羊水共90份，根据采集羊水过程中使用材质分为塑料组、塑料联合玻璃组、玻璃组，各30份。

1.2.3 羊水细胞收获 培养瓶制片：当每个羊水细胞克隆内细胞分布较均匀细胞不密集时，采用原位法制片。0.075 mol/L KCL 6 mL 37℃低渗35 min再加入固定液2 mL（甲醇：冰醋酸=3：1）混匀，预固定5 min后弃去50%再加入固定液2 mL混匀，5～10 min后全部倒掉再加入6 mL固定液-20℃冰箱过夜。第2天去除上盖，室温28℃湿度50%的环境中，沸水蒸汽上熏蒸30～40 s分散，缓慢干燥瓶壁。50℃烤片2.5 h，胰酶法G显带。培养皿制片：低渗固定步骤同上。第2天分散步骤同上，用中性树胶黏于盖玻片上。烤片显带同上。常规计数20个核型，分析4个分散良好、大于400条带的染色体核型，嵌合体核型计数增至100个分裂相。

选取培养良好的培养瓶和培养皿共100例，根据制片时环境温度和湿度分为4组，每组25例。①20℃室湿20%组；②28℃室湿20%组；③20℃湿度50%组；④28℃湿度50%组。每组在相应的温度、湿度环境下进行沸水蒸汽熏蒸分散核型步骤，显微镜下评定载玻片的得分。≥90分：可分析分裂相很多，每条染色体显带明显、着色适中均匀。89～80分：可分析分裂相比较多，叠加的染色体通过软件分开后都可辨认。79～70分：可分析分裂相适中，叠加的染色体通过软件分开后都可辨认。69～60分：有可分析分裂相，叠加的染色体通过软件分开后半数可辨认，其余得通过与另一有经验的诊断者讨论后才可确定。＜60分：可分析分裂相不多，叠加的染色体通过软件分开后半数可辨认。

1.3 统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（xˉ±s）表示，符合正态分布两组间比较采用LSD-t检验，不符合正态分布采用非参数检验。定性资料以频数（%）形式表示，采用χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 羊水培养结果435例标本培养成功406例，一次性培养成功率93.3%。

2.2 羊水离心后沉淀的颜色、多少的培养结局分析10～15 mm3棕色团块组和10～15 mm3鲜红色团块组细胞培养的成功率（72.72%、56.25%）较白色团块组培养的成功率（95.98%）均明显降低（P＜0.01）；10～15 mm3鲜红色团块组细胞培养的成功率较5～10 mm3鲜红色团块组培养的成功率明显降低（56.25%vs 90.48%，P＜0.01）。

2.3 不同材质的培养结局分析塑料组和塑料联合玻璃组细胞培养成功率（56.67%、70.00%）较玻璃组细胞培养成功率（93.33%）均明显降低（P＜0.01）。

2.4 不同环境温度和湿度的的核型分散程度得分20℃室湿20%组、28℃室湿20%组、20℃湿度50%组载玻片得分明显低于28℃湿度50%组（P＜0.01）；20℃室湿20%组、28℃室湿20%组载玻片核形分散程度得分明显低于20℃湿度50%组（P＜0.01），见表1。

表1 不同环境温度和湿度的核型分散程度得分（n=25）Table 1 Correlation analysis between environmental tem⁃perature and humidity and the degree of karyo⁃type dispersion（n=25）

3 讨 论

羊水细胞及绒毛细胞的染色体分析仍是唐氏综合征确诊的标准方法，由于羊水细胞大部分是衰老和固缩的脱落细胞，羊水细胞培养较其他组织培养更困难［2］。对严重鲜血性羊水来说，由于混入了大量的红细胞，红细胞凝集时不但把羊水细胞凝集起来严重影响成活羊水细胞的贴壁，还会占据培养瓶的表面导致培养失败。李从青等［3］研究发现羊水红细胞计数在羊水细胞培养结局中的差异无统计学意义。本研究发现，10～15 m3鲜红色团块组（代表穿刺出血较多）培养的成功率明显低于正常羊水，明显低于5～10 m3鲜红色团块（代表穿刺中有少量出血），与李从青等研究不同。周君等［4］研究发现，将带血的羊水离心后平均分置于4个培养瓶中，有效地降低血液的浓度，有利于羊水细胞贴壁。本实验对于有明显鲜血性的羊水，采取立即加入0.5 mL无菌肝素，然后离心并用培养液反复洗涤的方法，可以提高羊水培养的成功率；对于离心后少量残存的红细胞仍会占据培养瓶表面的问题，我们采用比正常羊水多加入2 mL培养液的方法稀释红细胞浓度，减少其对成活羊水细胞贴壁的影响。对于陈旧性出血的羊水来说，本研究发现可能是红细胞早已经破裂，最新脱落的胎儿细胞已经不受红细胞黏附的影响，所以成功率还是很高。本实验正常的羊水仍有29例培养失败，可能由于离心后沉淀的细胞太少导致。

接触羊水的耗材包括一次性注射器、离心管、吸管等塑料材质的耗材皆有细胞毒性。王文佳等［5］通过MTT检测法定量检测了一次性使用无菌注射器及活塞对小鼠成纤维细胞L-929的体外细胞毒性，结果表明注射器活塞存在4～5级细胞毒性，无菌注射器器身部分均存在3～4级细胞毒性，均呈重度细胞毒性。刘宇英等［6］研究一次性注射器所用的硅油润滑剂对家兔肺组织造成的损伤表明硅油润滑剂以散粒的形式经静脉进入机体，可对肺组织造成损伤。方天等［7］研究发现长时间尾静脉注射高剂量介孔二氧化硅纳米球溶液对小鼠肝和肺有一定程度的损伤。程玲等［8］研究发现，注射器灭菌的过程中，原材料聚丙烯和橡胶活塞吸附一定量的环氧乙烷，如果解析时间不够的话，残留的环氧乙烷就会产生较大的毒性。本研究发现，使用一次性塑料注射器抽取羊水后，即使后续操作使用玻璃器具，其培养的成功率还是低于使用玻璃注射器抽取的羊水，究其原因为一次性注射器的细胞毒性所致。常规使用的吸管、离心管等大多为聚乙烯或聚氯乙烯等材质，对细胞和蛋白质类的物质有很大的吸附性。塑料器具的使用会损失一部分羊水细胞，增加了羊水细胞培养的难度。本实验将器具皆换成玻璃材质后，发现培养的成功率明显提高了。实验所用玻璃器具皆用酸液浸泡后高压灭菌，穿刺针用84消毒液浸泡后高压灭菌。

培养成功后，制作完美的核型分析载玻片是能否做出最后诊断的关键步骤。大多数实验人员在固定步骤完毕后，就直接在室温中进行核型分散的操作，未考虑温度湿度对核型分散程度的影响。本研究发现，在湿度50%的环境中要比直接在室湿中熏蒸的核型更加容易分散，室温室湿与28℃室湿差异无统计学意义。可见湿度在后期制片方面起着决定性的作用，其原因可能与细胞受热剧烈膨胀至破裂后，单条染色体在合适的温度湿度条件下更加容易分散有关。

原位培养法还需要注重收获时间，如时间过早或过晚在原位片上就得不到满意的分裂相。细胞和克隆形态分为3类：F克隆、AF细胞克隆及E类克隆。如果上皮细胞和类纤维细胞生长过度可以适当增加KCL的用量和低渗的时间，有助于克服不宜分散的难题。培养至第6～8天观察时发现羊水细胞克隆内细胞分布较密集时，我们一般不采用直接原位法制片，而是采用细胞刮方法传代，培养瓶中加入3.5mL新鲜培养液刮下数个“鱼眼样”的细胞克隆，用吸管在瓶内吹打30～40下，让细胞重新贴壁生长，培养1～3d后再原位法制片，这样制作的核型片子更易于观察。

综上所述，通过对影响羊水细胞培养及核型分散的因素分析证明，及时、正确的处理带血的羊水标本，全部采用玻璃材质的器具，控制好分散过程中环境的温湿度（最佳28℃、50%），抓住羊水细胞收获时机，可以提高羊水细胞培养的成功率。