响应面法优化超声辅助提取明月草中总黄酮工艺研究

尹伟

(安徽新华学院药学院，安徽 合肥 230088)

林腾

(安徽省铜陵市义安区食品药品监督管理局，安徽 铜陵 244105)

张国升

(安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230031)

明月草(AngelicaKeiskei)为多年生常绿植物，高30～80cm，叶子为卵圆形，生命力极强。明月草内黄酮类成分含量丰富，包括特有成分查尔酮等，被誉为21世纪人类的健康食品。现代研究显示，植物黄酮类化合物对生物体内的自由基有很好的清除作用，同时具有抗氧化等作用[1]，能够有效地降低动物体内的总胆固醇以及甘油三脂的含量，也有很好的抗病毒等作用[2,3]。明月草中黄酮类成分具有降血糖等生物活性，目前已作为有生物活性的天然产物，成为研究热点[4～9]。

目前，关于明月草总黄酮的提取方法研究较少，未见关于明月草总黄酮提取工艺上各影响因素之间的交互作用报道。传统的正交试验对各项试验因素的考察，由于试验误差较大，已经不能很好的满足相关试验要求。超声辅助提取方法，是利用超声波的粉碎技术，使得植物的成分能够更好地溶出，比传统提取方法收率高[10]。为此，笔者在前期研究的基础上，进一步对明月草总黄酮的提取工艺进行研究。该研究采取响应面法，优化总黄酮提取工艺，观察超声提取功率、液料比、超声功率以及超声时间等因素对明月草总黄酮提取收率的影响，旨在为明月草总黄酮的进一步研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

明月草采自安徽合肥。

无水乙醇、氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠(国药集团化学试剂公司)，芦丁标准品(中国食品药品检定研究院)。所有试剂均为分析纯。

紫外分光光度计(UV-9000，上海奥西科学仪器有限公司)；电子天平(Sartorius BT)；离心机(GT10-1，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1标准曲线的建立

将新鲜的明月草洗净、晾干、粉碎，放置干燥器中备用。精确称取芦丁(干燥至恒重)的芦丁标准品1.0mg，用乙醇定溶至100mL，得0.1mg/mL的标准液。精确吸取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的标准液，分别置于10mL比色管中，分别加入30%的乙醇5mL，5%亚硝酸钠0.3mL，摇匀，静置10min，加入10%硝酸铝0.3mL，摇匀，静置10min，加1mol/L氢氧化钠溶液4mL，加去离子水定容，摇匀，静置10min。用空白试剂作为参比液调零，测定吸光度(510nm)。以吸光度A作为纵坐标，质量浓度Y作为横坐标，得标准曲线方程为：Y= 0.0886A-0.0007，R2= 0.9997，线性关系良好。

1.2.2明月草总黄酮的提取

精确称取10g明月草粉末，置于250mL的烧杯中，加入100mL 70%(体积分数)的乙醇溶液，在功率为200W的超声清洗器中提取5h，提取完成后，离心(5000 r/min)0.5h，去上清液于250mL定容。

1.2.3明月草总黄酮的测定

采用硝酸铝-亚硝酸钠法测定，取1mL提取液按照测定标准曲线的方法测定吸光度A，通过标准曲线算出样品的质量浓度Y，同时计算得出总黄酮的收率：

式中，Y为样品中总黄酮质量浓度，mg/mL；m为明月草粉末的质量，g；V1为比色管中溶液体积，mL；V2为待测样分取的体积，mL；V3为待测样的总体积，mL。

1.2.4单因素试验

1)提取溶剂乙醇体积分数对明月草总黄酮收率的影响 设定超声时间为2h、液料比为50∶1、超声功率为200W，考察乙醇体积分数为40%、50%、60%、70%、80%、90%时对明月草总黄酮收率的影响。

2)液料比对明月草总黄酮收率的影响 采用优化后的乙醇体积分数，选择超声时间为2h，超声功率为200W，考察液料比分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1(mL/g)时对明月草总黄酮收率的影响。

3)超声时间对明月草总黄酮收率的影响 采用优化后的乙醇体积分数、液料比，选取超声功率为200W，考察超声时间分别为0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h时对明月草总黄酮收率的影响。

4)超声功率对明月草总黄酮收率的影响 采用优化后的液料比、乙醇体积分数、超声时间，考察超声功率分别为100、150、200、250、300、350、400、450W时对明月草总黄酮收率的影响。

5)提取温度对明月草总黄酮收率的影响 采用优化后的液料比、乙醇体积分数、超声时间、超声功率，考察提取温度分别为40、50、60、70、80、90℃时对明月草总黄酮收率的影响。

1.2.5Box-Benhnken试验设计

综合单因素试验后，选择超声时间等作为自变量，明月草总黄酮的收率作为因变量(响应值)，使用Box-Benhnken方法[11]优化明月草总黄酮的提取工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

单因素试验结果见图1。

2.1.1乙醇体积分数对明月草总黄酮收率的影响

由图1(a)可知，提取溶剂乙醇体积分数小于70%时，随着乙醇体积分数的不断增加，总黄酮的收率亦是不断升高。但当乙醇体积分数大于70%时，总黄酮的收率逐渐下降。这可能是因为明月草中黄酮极性范围较大，70%的乙醇的极性与明月草黄酮中的黄酮化合物极性相似，随着乙醇体积分数的上升，导致明月草中糖类等化合物析出，最终导致黄酮类化合物溶出的降低[12]。

2.1.2液料比对明月草总黄酮收率的影响

由图1(b)可知，随着液料比的不断增大，总黄酮的相应收率也在不断增加，同时在40∶1～60∶1时趋于平衡，在50∶1时的总黄酮的收率最大，但在大于60∶1时，总黄酮的收率不断下降，可能是因为在液料比50∶1时，溶剂已经能够充分包裹物料，即使此时增加相应的溶剂比例，也不能有效地提高总黄酮的收率。

2.1.3超声时间对明月草总黄酮收率的影响

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由图1(c)可知，在超声时间为3h时，明月草总黄酮的收率最高，随着时间的延长，收率缓慢下降。可能是因为在3h时，明月草的黄酮类化合物已经完全溶出，3h后有部分黄酮类化合物被超声波破坏分解，导致明月草总黄酮收率降低。

2.1.4超声功率对明月草总黄酮收率的影响

由图1(d)可知，在超声功率小于350W时，随着超声功率的增大，明月草总黄酮的收率是不断升高的，但大于350W时，收率出现了下降。可能是由于明月草中能使得黄酮类物质降解的酶等物质被不断释放出来，影响总黄酮收率[13]。

2.1.5提取温度对明月草总黄酮收率的影响

由图1(e)可知，随着明月草总黄酮提取温度的不断升高，在温度约为80℃时，总黄酮的收率最大，但在温度升高至80℃后，温度对总黄酮的收率影响较小，且趋于稳定。因此，选取温度80℃作为提取明月草总黄酮的条件，但不作为响应面优化试验的相关指标。

图1 明月草总黄酮提取中各种单因素试验结果

2.2 Box-Benhnken试验设计结果

Box-Benhnken 试验因子及编码值详见表1，试验审计编排组合见表2。

2.3 响应面试验结果

Y= 12.89+0.071A-0.25B+0.31C+0.28D-0.0065AB-0.18AC+0.14AD+0.061BC+0.38BD+0.24CD-0.33A2-0.40B2-0.27C2-0.52D2

由表3方差分析与显著性检验可得出，回归方程模型极显著(P<0.01)，方程失拟项不显著(P= 0.7103)，表明该回归模型与实测值能较好的拟合。回归系数R2=0.9997>0.9，表明该模式相关度较好。在一次项的F检验可以得到，各考察因素对明月草总黄酮收率的影响因素为：C>D>B>A，已经达到极显著水平[14]。

表1 明月草总黄酮提取试验因素水平编码表

表2 明月草总黄酮提取试验设计与结果

表3 方差分析

2.4 响应面分析图

响应面图形是由相应的响应值与对应的试验因素(A、B、C、D)之间所形成的曲面图形以及等高线图形，如图2所示，能够直观地对各因素及其各因素之间的交互作用进行有效反映。

图2 各单因素之间相互影响及等高线分析图

响应面的坡度越陡峭，表示相应的响应值对相关条件越为敏感，对黄酮收率的影响就越大，反之则显示因素对黄酮的影响就越小，同时由等高线可以得到其极值的相关条件在圆心[9]。

由图2可知，4个因素下各响应面的坡度都比较陡峭，说明液料比、乙醇体积分数、超声时间、超声功率对明月草总黄酮的提取收率影响都非常显著。由图2(a)可以看出，乙醇体积分数与液料比对总黄酮收率影响较为显著，等高线为椭圆形，两者之间的交互作用显著。由图2(b)可以看出，超声时间与液料比两因素中，当超声时间约在3h时，明月草总黄酮收率最高。由图2(c)得出，超声功率在一定范围内能有效增加明月草总黄酮的收率，但在大于350W时，表现出下降趋势。由图2(d)、2(e)、2(f)可以看出,超声时间与乙醇体积分数、超声功率与乙醇体积分数、超声功率与超声时间都表现非常好的交互作用，对明月草总黄酮的影响较大。

2.5 优化提取参数和验证模型

经响应面法数据分析，最终确定明月草总黄酮的最佳提取条件为乙醇体积分数70%，液料比50∶1，超声时间3h，超声功率350W，提取温度80℃，明月草总黄酮收率的最大预测值为7.23%。按上述相关提取条件，进行验证性试验，收率为6.89%，误差较小。

3 结语

1)通过Box-Behnken组合设计以及响应面分析，建立了明月草总黄酮的数学模型，探讨了超声时间、液料比、超声功率以及乙醇体积分数对明月草总黄酮收率的影响。

2)经响应面法数据分析，最终确定明月草总黄酮的最佳提取条件为：乙醇体积分数70%，液料比50∶1，超声时间3h，超声功率为350W，提取温度为80℃。据该条件，验证性试验得其收率为6.89%，与预测值相符性较好。

3)试验所得到的明月草总黄酮的提取工艺有较好的应用性，能为明月草总黄酮的提取工艺优化提供参考，为明月草植物资源的综合利用提供依据。