香樟叶挥发油的止痒作用研究

杨锦强，杨念云

（南京中医药大学，南京 210023）

香樟叶挥发油含有多种成分主要为芳樟醇，樟脑，石竹烯，桉叶油醇等成分[1]。香樟叶挥发油具有抑菌作用[2-4]，但止痒效果和具体的作用机制近年来却少见于文献报道。目前，皮肤瘙痒症状在临床上非常常见，常用糖皮质激素类药物来治疗各种皮肤病，但不良反应明显[5]。中华本草认为香樟具有止痒功效，本实验将香樟叶挥发油应用于皮肤瘙痒的治疗，为应用于临床做基础性研究。采用4-氨基吡啶瘙痒模型[6-8]和2，4-二硝基氟苯变态反应性接触性皮炎模型[9]来观察香樟叶挥发油对皮肤瘙痒的止痒作用，观察其对局部组织的作用，运用血清酶联免疫吸附测定（ELISA）方法观察其对几种与瘙痒相关的细胞因子的影响，以期阐明香樟叶挥发油的止痒机制。

1 材料

1.1 实验动物 ICR小鼠64只SPF级，体质量20～22 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供（动物合格证号：NO201725010），实验前动物在SPF级饲养室饲养3d后用于实验，饲养室室温20～25℃，相对湿度40%～60%。

1.2 实验药品和仪器 香樟叶于2017年9月份采自南京中医药大学校园内，所有样品均经南京中医药大学杨念云副研究员鉴定，标本保存于南京中医药大学生药学实验室。栗米油，复方地塞米松乳膏（三九医药股份有限公司，批号44024170），地塞米松片（浙江仙据制药股份有限公司批号170239），4-氨基吡啶（梯希爱化工合成发展有限公司），2，4-二硝基氟苯（麦克林公司，批号C10104378），小鼠血清5-羟色胺（5-HT）测定试剂盒，白细胞介素-4（IL-4）测定试剂盒，白三烯B4（LTB4）试剂盒均购于上海源叶生物有限公司。

TGL-16C台式离心机，上海安亭科学仪器厂；FA1204B分析天平，上海精科天美仪器有限公司。

2 实验方法

2.1 香樟叶挥发油的提取 称取500 g香樟叶（经粉碎），置于圆底烧瓶中，水蒸气蒸馏2 h，挥发油得率为 1．72%（V/W），具有特殊香味。

2.2 4 -氨基吡啶致小鼠瘙痒实验

2.2.1 实验动物分组 ICR雌性小鼠32只，随机分成4组，每组8只。分别是：模型组、阳性对照组（复方地塞米松乳膏）、挥发油溶液高剂量组（体积分数80%）、挥发油溶液低剂量组（体积分数20%），挥发油用栗米油配制成溶液。

2.2.2 实验动物建模与给药方法 在各组小鼠的颈背部脱毛，面积为2 cm×3 cm，24 h后给药。模型组的脱毛区涂栗米油2．5 mL/kg，高剂量组的脱毛区涂2．5 mL/kg浓度为80%的挥发油溶液，低剂量组的脱毛区涂2．5 mL/kg浓度为20%的挥发油溶液，阳性对照组的脱毛区涂复方地塞米松乳膏20 g/kg。给药30 min以后，在所有小鼠的颈背部皮下注射4-氨基吡啶溶液1 mL/kg（4-氨基吡啶先用生理盐水配制成0．5%的溶液，实验前再用生理盐水将其稀释成 0．01%的溶液）。

2.2.3 实验动物的舔体反应次数、生化指标的测定和组织样品的观察 在小鼠的颈背部皮下注射4-氨基吡啶溶液后，立即观察小鼠在10 min内的舔体次数，10 min后，将小鼠摘眼球取血，将血液静置冰浴10 min，离心机3 000 r/min离心30 min，吸取上清液，-20℃保存，采用各试剂盒的给定方法，每个样本平行测定2次，分别测定血浆中的5-HT、IL-4和LTB4的含量。

取完血后，通过后颈椎脱臼的方式处死小鼠，取注射部位的皮肤（1 cm×1 cm）一块，用福尔马林浸泡、石蜡包埋、切片、苏木精-伊红（HE）染色，用显微镜观察注射部位周围的真皮组织变化。

2.3 2 ，4-二硝基氟苯致小鼠变态反应性接触性皮炎实验

2.3.1 实验动物分组 ICR雌性小鼠32只，随机分成4组，每组8只。分别是：模型组、阳性对照组（地塞米松3．25 mg/mL）、挥发油溶液高剂量组（体积分数5%）、挥发油溶液低剂量组（体积分数1．25%），挥发油用栗米油配制，地塞米松研磨成粉末后也用栗米油配成混悬液。

2.3.2 实验动物建模与给药方法 在小鼠腹部脱毛，面积为3 cm×3 cm，24 h后给药。第1天，模型组灌服20 mL/kg的栗米油，高剂量组灌服20 mL/kg浓度为5%的挥发油溶液，低剂量组灌服20 mL/kg浓度为1．25%的挥发油溶液，阳性对照组灌服20 ml/kg浓度为3．25 mg/mL的地塞米松混悬液。灌胃给药每天1次，连续5 d，再于第7天诱发前2 h给药1次。第 2天（致敏期）在脱毛区外涂 25 μL 0．5%的 2，4-二硝基氟苯溶液（丙酮配制）致敏。第7天（诱发期）在小鼠的左耳每面外涂5 μL 0．5%的2，4-二硝基氟苯溶液诱发皮炎。

2.3.3 实验动物生化指标的测定 各组小鼠于诱发后48 h，将小鼠摘眼球取血，将血液静置冰浴10 min，离心机3 000 r/min离心30 min，吸取上清液，-20℃保存，采用各试剂盒的给定方法，每个样本平行测定两次，分别测定血浆中的IL-4和LTB4的含量。

2.4 统计学处理 应用SPSS 19．0统计软件分析，实验数据以标数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P＜0．05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 舔体反应实验结果 与模型组相比，香樟叶挥发油高、低剂量组10 min内舔体次数均显著减少（P＜0．01），表明香樟叶挥发油具有显著的止痒功效，结果见表1。

表1 香樟叶挥发油对舔体反应的影响（±s）Tab.1 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on lick reaction(±s)

表1 香樟叶挥发油对舔体反应的影响（±s）Tab.1 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on lick reaction(±s)

注：与模型组比较，**P＜0．01。

组别模型组香樟叶挥发油高剂量组香樟叶挥发油低剂量组阳性对照组动物数8 8 8 8浓度（%） 舔体次数（次）—29．88±3．00 80 9．63±1．51**20 17．5±2．14**0．1 21．88±2．47**

3.2 血清ELISA检测结果 4-氨基吡啶瘙痒模型中按血清ELISA检测试剂盒说明书要求分别检测小鼠血清中5-HT，LTB4，IL-4的水平，结果发现香樟叶挥发油高剂量组及阳性对照组小鼠血清中5-HT 和 LTB4的浓度显著降低（P＜0．05），但香樟叶挥发油高、低剂量组及阳性对照组对IL-4的影响均无显著性影响（P＞0．05），结果见表 2。

2，4-二硝基氟苯变态反应性接触性皮炎模型中按血清ELISA检测试剂盒说明书要求分别检测小鼠血清中LTB4，IL-4的水平，结果发现香樟叶挥发油高剂量组及阳性对照组小鼠血清中LTB4的浓度显著降低（P＜0．05），但香樟叶挥发油高、低剂量组及阳性对照组对IL-4的影响均无统计学意义（P＞0．05），结果见表 3。

表2 香樟叶挥发油对4-氨基吡啶瘙痒模型血清生化指标的影响（±s）Tab.2 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on serum biochemical indicators in the model of pruritus induced by 4-aminopyridine(±s)

表2 香樟叶挥发油对4-氨基吡啶瘙痒模型血清生化指标的影响（±s）Tab.2 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on serum biochemical indicators in the model of pruritus induced by 4-aminopyridine(±s)

注：与模型组比较，*P＜0．05。

组别模型组香樟叶挥发油高剂量组香樟叶挥发油低剂量组阳性对照组动物数8 8 8 8浓度（%） 5-HT（ng/mL） LTB4（pg/mL） IL-4（pg/mL）—81．76±3．74 50．65±4．51 17．56±1．18 80 76．10±3．42* 44．59±2．22* 16．64±4．16 20 78．99±1．72 47．86±3．25 18．31±2．31 0．1 75．16±5．17* 44．76±3．23* 18．31±2．12

表3 香樟叶挥发油对2，4-二硝基氟苯变态反应性接触性皮炎模型血清生化指标的影响（x±s）Tab.3 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on serum biochemical indicators in the model of allergic contact dermatitis induced by 2，4-dinitrofluorobenzene(±s)

表3 香樟叶挥发油对2，4-二硝基氟苯变态反应性接触性皮炎模型血清生化指标的影响（x±s）Tab.3 Effects of essential oil of Cinnamomum camphora leaves on serum biochemical indicators in the model of allergic contact dermatitis induced by 2，4-dinitrofluorobenzene(±s)

注：与模型组比较，*P＜0．05。

组别模型组香樟叶挥发油高剂量组香樟叶挥发油低剂量组阳性对照组动物数8 8 8 8浓度（%）LTB4（pg/mL）IL-4（pg/mL）— 47．16±2．66 20．84±1．54 2．5 43．99±2．87* 19．91±1．40 1．25 46．39±1．95 18．99±2．06 3．25 43．50±2．40* 20．39±4．54

3.3 HE染色镜下观察结果 在香樟叶挥发油对于4-氨基吡啶瘙痒模型止痒作用的研究中病理检查显示模型组皮肤真皮层轻度水肿，大量炎细胞，香樟叶挥发油高剂量组和阳性药组未观察到异常，香樟叶挥发油低剂量组真皮层轻度增厚，结果见图1。结合舔体实验结果可以推测香樟叶挥发油高、低剂量组和阳性药对照组对4-氨基吡啶瘙痒模型出现的急性炎症反应有一定的抑制作用。

4 讨论

瘙痒是一种能引起搔抓欲望的主观感觉。痒觉感受器存在于真皮与表皮连接处的感觉神经游离末梢，这些感受器可以特异性结合致痒因子，即疡痒的传导介质庄要包括胺类、蛋白酶、生长因子、神经肚、类阿片物质、二十烷类细胞素等。这些传导介质常表达于不同的皮肤细胞，如角质细胞、上皮细胞、内皮细胞，不同的痒觉感受器与不同的致痒因子特异结合后，传递冲动产生痰痒[10]。当被致痒因子刺激后，一种特异的C纤维将冲动传至脊髓的背侧角，然后通过脊髓丘脑束至丘脑的板层核，最后到达大脑皮层(躯体感觉区)，进而产生搔抓反射[11]。本实验通过局部注射致痒物质建立痰痒动物模型，属感受性瘙痒。并通过瘙痒程度比较用不同致痒物质以及不同建立方法建立的瘙痒。很多皮肤病都可产生瘙痒症状，常见的有过敏性皮肤病、特应性皮炎、疱类皮肤病等，相同的致痒介质在不同疾病瘙痒的发生中发挥的作用可能不同，在同一疾病发展的不同阶段中可能有不同的介质参与瘙痒的发生[12]。日常生活中蚊虫叮咬、疥虫寄生等也会引起皮肤瘙痒。目前暂时还没有特异性的止痒治疗方法，通过活性药物拮抗瘙痒介质是最有希望的止痒策略[13]。4-氨基吡啶是一种钾通道阻滞剂同时也具有促肥大细胞释放组胺的作用，组胺是人们最早发现的瘙痒介质之一在许多过敏性疾病的动物模型建立中都有广泛的应用[8]。2，4-二硝基氟苯虽不能直接致痒，但是在很多考察瘙痒机制或药物的止痒活性中可用其建立变态反应性接触性皮炎模型进行研究。反复将2，4-硝基氟苯应用于小鼠耳上，会导致小鼠耳肿胀，血清特异性IgE水平升高[14]。5-HT是一种在皮肤瘙痒症及其他瘙痒性疾病中起重要作用的介导物质，在人类及鼠类均能引发显著的瘙痒反应[12]。LTB4是一个强有效的炎症介质，目前推测LTB4可能的致痒机制为通过致敏皮肤的C类神经纤维的伤害感受器而直接作用于皮肤感受伤害的无髓鞘的C类神经纤维末梢，而痒的传导正是由这一类纤维介导的和作用于白细胞或皮肤的其它细胞而释放致痒介质[15]。

图1 HE染色结果Fig.1 Results of HE staining

本研究结果表明，香樟叶挥发油能抑制4-氨基吡啶和2，4-二硝基氟苯引起的瘙痒，从血清ELISA检测的结果也发现，薄香樟叶挥发油对小鼠的血清LTB4，5-HT浓度有显著的减少，但香樟叶挥发油对血清IL-4无显著的影响。结合病理切片的结果来看，表明香樟叶挥发油具有显著的止痒作用，其机制为影响一些相关因子发挥作用。香樟叶挥发油的止痒作用与其化学成分的关系有待进一步研究。