温阳补肾方对兔激素性股骨头坏死组织中骨保护素和核因子-κB受体活化因子及其配体mRNA表达的影响

宋红梅，魏迎辰，李楠，王和鸣,

1.福建中医药大学附属第二人民医院，福建福州市350003；2.安徽中医药大学第二附属医院，安徽合肥市230061；3.福建中医药大学，福建福州市350122

激素性股骨头坏死(steroid-induced avascular necrosis of femoral head,SANFH)指大剂量激素引起的股骨头中活性成分死亡的病理过程，如脂肪细胞、骨髓造血细胞和骨髓细胞等[1]。有研究认为，激素已成为导致非创伤性股骨头坏死的主因[2]。温阳补肾方作为福建中医药大学附属第二人民医院的院内协定方，大量临床应用结果证实其治疗SANFH疗效确切。本研究观察温阳补肾方对兔SANFH组织中骨保护素(osteoprotegerin,OPG)、核因子-κB受体活化因子(receptor activator of nuclear factor-kappa B,RANK)和核因子-κB受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand,RANKL)的mRNA表达的影响，探讨其防治SANFH的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

46只普通级新西兰兔，雌雄各半，体质量1.7～2.5 kg，上海市松江区松联实验动物场提供，许可证号SCXK(沪)2012～0011。研究过程中对动物的处理均按照国家颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》和福建中医药大学医学伦理委员会的要求严格执行。

1.2 实验药品、试剂及仪器

1.2.1 温阳补肾方制备

组成：骨碎补9 g、巴戟天15 g、鹿角胶6 g、淫羊藿9 g、三七3 g、丹参9 g、黄芪15 g、牛膝9 g、郁金9 g、甘草3 g。由福建中医药大学附属第二人民医院制备，生药浓度2.5 g/ml。

1.2.2 实验试剂

甲泼尼龙琥珀酸钠，500 mg/瓶，批号Z06177，附稀释液1瓶：美国辉瑞制药有限公司。特级马血清，200 ml/瓶，批号20121121：北京索莱宝生物科技有限公司。

1.2.3 实验仪器

BM-Ⅶ生物组织包埋机：孝感宏业医疗仪器公司。UC6超薄切片机：德国LEⅠCA公司。生物蛋白质垂直电泳仪：北京百晶。凝胶成像系统：上海培清科技有限公司。微量紫外分光光度计：美国NANODROP公司。9600型PCR仪：美国PE生物系统公司。

1.3 方法

1.3.1 实验分组

46只新西兰兔(普通级)适应性喂养2周，分为正常组(n=10)和造模组(n=36)。造模后随机选取正常组2只、造模组4只处死，用于模型鉴定。再将造模组剩余32只采用随机数字法分为模型组，中药低、中、高剂量组，每组8只。整个实验按照国际动物保护条例进行[3-4]。

1.3.2 造模及鉴定

应用改进马血清联合甲基强的松龙法造模[5]。完成后，运用光学显微镜，通过观察股骨头的病理改变、骨小梁及骨陷窝的变化进行模型鉴定。

1.3.3 药物干预

正常组和模型组只用10 ml/d生理盐水灌胃。中药3个剂量组按照以下标准灌胃：依照Meeh-Rubner公式[6]计算，A(体表面积，m2)=K(系数)×W(体质量，g)×2/3×10-4联合人兔用药剂量换算公式最后算得，中药低、中、高剂量组分别为6.44 g/(kg·d)、9.66 g/(kg·d)、12.88 g/(kg·d)[7]。每天灌胃，连续8周后取材。

1.4 评价方法

1.4.1 组织病理学观察

造模后，随机选取正常组2只，造模组4只处死，取材、脱钙、切片、常规HE染色。

正常组2只双侧股骨头(n=4)，造模组4只双侧股骨头(n=8)。光镜下统计两组骨陷窝和空骨陷窝的数目，于10×40倍的高倍镜下从各观测切片中选3个不重复区域，每个区域内选取骨陷窝50个，从中获得空骨陷窝的数目，由此计算空骨陷窝率(空骨陷窝率=空骨陷窝数/50×100%)。3个区域共得出3个空骨陷窝率，取平均值[8]。

1.4.2 逆转录聚合酶链反应检测OPG、RANK和RANKL的mRNA表达

温阳补肾方连续灌胃8周后，空气栓塞法处死兔子。首先进行RNA提取，将-80℃冰箱内的组织标本量共l00 mg在液氮内捣碎研磨，常温裂解，离心提取，用DEPC水、氯仿、异丙醇、乙醇处理离心纯化；再应用微量紫外分光光度计进行RNA浓度与纯度的测定，采用凝胶成像软件观测所选RNA跑出的的电泳带图像，进行RNA完整性的测定；用DNase处理提取的RNA，以TOYOBO的反转录反应试剂盒继续完成cDNA合成操作，在PCR反应仪内做反转录。然后进行荧光定量PCR，应用Primer 5.0软件对引物序列加以设计；最后PCR产物进行琼脂糖电泳。用凝胶图像处理系统分析，mRNA表达水平均以目标因子与β-actin比值表示。引物均由上海生工公司供给。序列见表1。

1.5 统计学分析

选用SPSS 17.0软件对结果进行统计处理。计量资料以(±s)表示，模型鉴定用独立样本t检验；组间比较应用单因素方差分析，方差齐用LSD方法，方差不齐用Games-Howell方法。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 组织病理学观察

2.1.1 HE染色

正常组骨小梁致密规则，结构正常，股骨头软骨厚度适中，表面光滑；骨细胞形态一律正常，核居于骨陷窝中央；股骨头各层细胞均匀分布，可见大量规则排列的软骨细胞，偶尔可见散在的空骨陷窝；髓腔内分布着大量的骨髓细胞，少量正常的脂肪细胞。见图1。

模型组股骨头软骨变薄，软骨表面出现剥脱裂纹；骨小梁稀疏，不规则，甚至断裂；各种细胞呈散在不规则排列。与正常组比较，骨细胞减少，形成大量空骨陷窝；软骨细胞少见，出现广泛簇积现象；骨髓细胞数减少，髓腔内随处可见肥大、变性、坏死甚至形成囊泡融合的脂肪细胞。见图2。

表1 引物序列

图1 正常组HE染色

图2 模型组HE染色

2.1.2 空骨陷窝率

模型组空骨陷窝率显著高于正常组(P＜0.001)。见表2。

表2 正常组与模型组空骨陷窝率比较(%)

2.2 OPG、RANK和RANKL的mRNA表达

2.2.1 OPGmRNA表达

与正常组比较，模型组OPG mRNA表达明显降低(P＜0.01)；与模型组比较，中药各剂量组OPG mRNA表达均明显升高(P＜0.01)；中药中、高剂量组较中药低剂量组OPG mRNA表达明显升高(P＜0.01)；中药中、高剂量组比较无显著性差异(P＞0.05)。见表3、图3。

2.2.2 RANK mRNA表达

与正常组比较，模型组RANK mRNA表达明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，中药各剂量组RANK mRNA表达均明显降低(P＜0.01)；中药中、高剂量组较中药低剂量组RANK mRNA表达明显降低(P＜0.01)；中药中、高剂量组比较无显著性差异(P＞0.05)。见表3、图3。

2.2.3 RANKL mRNA表达

与正常组比较，模型组RANKL mRNA表达明显升高(P＜0.01)；与模型组比较，中药各剂量组RANKL mRNA表达均明显降低(P＜0.01)；中药中、高剂量组较中药低剂量组RANKL mRNA表达明显降低(P＜0.05)；中药中、高剂量组比较无显著性差异(P ＞ 0.05)。见表3、图3。

图3 各组OPG、RANK和RANKL的mRNA表达

3 讨论

SANFH病因病机尚未完全明确，存在多种学说[9-14]。有学者认为，一方面激素直接作用于成骨细胞、骨细胞和破骨细胞，减缓成骨细胞的分化和增殖速度，使成骨细胞迅速凋亡，提高破骨细胞的存活时间，导致骨量流失，伴随股骨头塌陷；另一方面，激素还可加速血管内皮细胞凋亡，从而促使血栓的形成，通过抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达，抑制血管修复和血管新生，导致血管舒缩活性物质表达障碍，影响脂质代谢。

因此，促进新骨的形成已经成为治疗SANFH核心要素。OPG、RANK和RANKL作为肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)的家族成员，可以调节破骨细胞和骨吸收过程，而且在骨吸收和骨重建过程中起着非常重要的作用[15-16]。RANK作为RANKL的受体，分布于破骨细胞前体细胞膜。作为Ⅱ型跨膜蛋白，RANKL可直接与RANK结合，通过促使破骨细胞前体向成熟破骨细胞转化，直接激活成熟破骨细胞，最终诱导骨吸收。因此在破骨细胞发育和活化的过程中，RANKL成为非常关键的因素[17]。OPG和RANKL的竞争性结合可阻断骨吸收的信号转导通路，也阻碍破骨细胞的发育和成熟。

传统医学称本病为“骨蚀”“骨痿”“骨痹”等。“邪之所凑，其气必虚”，机体受到病邪入侵，脏腑器官的功能随之受损，导致人体抵抗力下降。因此，许多学者将本病的内因归为先天禀赋不足，素体气虚，气不卫外，外邪侵袭而发为本病；认为外邪内袭或跌扑损伤等为本病致病的外因，均能导致经脉损伤，气血失司，瘀阻于脉络，致使股骨头缺血，日久发为本病。本病的致病外邪多为寒邪、湿邪、热邪等。寒邪为阴邪，“阴胜则阳病”，故寒胜即损伤阳气，致血液凝滞，瘀阻在局部从而导致骨坏死。另外，内服伐损药物而损伤正气、劳损、创伤、内伤七情、外感六淫和饮食不节等所导致的内伤，均会造成局部的气血失司而发生股骨头坏死。传统医学干预SANFH，多从整体观念入手，认为其本在于骨，其源在于血，其根在于肾[18]。

王和鸣制定出活血祛瘀、温阳补肾的治疗大法，认为“补虚重在补肾，补肾重在温肾壮阳”[19]，阳气充盛，温煦和推动之力增强，气行则血行。前期研究表明[7,20-27]，温阳补肾中药可促进成骨细胞增殖，刺激成骨细胞分泌碱性磷酸酶(alkaline phosphates,ALP)与骨钙素(bone glaprotein,BGP)，刺激成骨细胞表达转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)，并形成大量的Ⅰ型胶原，以利于骨生成。SANFH血清OPG下降，RANKL上升，OPG/RANKL值下降。温阳补肾方可以提高血清OPG、BGP、N-末端Ⅰ型前胶原肽(procollagen ⅠN-terminal propeptide,PⅠNP)表达，降低RANK和RANKL表达，抑制破骨细胞的活化，促进新骨的形成。

本研究选用成年新西兰大白兔，按照改进马血清联合甲基强的松龙的造模法进行造模，结果发现，模型组股骨头软骨变薄，软骨表面出现剥脱裂纹；骨小梁稀疏，不规则，甚至断裂；各种细胞呈散在不规则排列。骨细胞减少，形成大量空骨陷窝；软骨细胞出现广泛簇积现象；骨髓细胞数减少，髓腔内随处可见肥大、变性、坏死甚至形成囊泡融合的脂肪细胞。模型组空骨陷窝率增加，OPG mRNA表达降低，RANK和RANKL的mRNA表达均升高。中药各剂量组OPG mRNA表达升高，RANK和RANKL的mRNA表达均降低，中、高剂量组比低剂量组更明显，中、高剂量组之间无显著性差异。这表明温阳补肾方能提高SANFH股骨头组织中OPG mRNA表达，抑制RANK和RANKL的mRNA表达。

综上所述，温阳补肾方可以调节OPG、RANK和RANKL的mRNA表达，从而加速诱导成骨细胞及破骨细胞活性，可能为温阳补肾方有效防治SANFH的机制之一。本研究结果显示，中剂量为温阳补肾方使用的最佳剂量选择，还有待临床进一步证实。本研究为仅以股骨头组织为实验对象的体内实验，还需要体外实验进一步阐明温阳补肾方对SANFH的疗效机制。