响应面法优化莲花总黄酮超声辅助提取工艺及其抗氧化性的研究

贺文韬，林 林，陈雨涔，陈 浩，邓尚贵

(1.浙江海洋大学食品与医药学院，浙江舟山 316022；2.舟山市农林科学研究院，浙江舟山 316000；3.舟山市普陀农林局，浙江舟山 316100)

莲花Nymphaea hybrid 属睡莲科Nymphaeaceae、睡莲属Nymphaea 多年生宿根水生植物，为大型睡莲。其香味淡雅高贵，花期长，在餐饮、医疗、净化和修复环境等方面都有广泛的应用，具有很大的经济价值、生态价值和观赏价值。莲花中含有丰富的植物胎盘素、黄酮、粗多糖、生物碱、低聚糖等活性成分[1]，其醇提物具有降血脂[2]、美白[3-4]、抑制前列腺增生[5]、保护急性酒精肝损伤[6]等功效。莲花中所含黄酮类化合物具有消炎、抗菌及抗氧化作用[7-11]。任红荣等[12]研究了微波法提取莲花中总黄酮工艺，黄酮得率为2.065%较低。本研究旨在通过响应面法优化莲花总黄酮超声辅助的提取工艺，得到较高的提取率，为进一步开发利用莲花提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

莲花样品由舟山市农林科学院提供，产地浙江舟山。2018年8月采摘，剥去叶片，贴近花托基部切去花梗，鼓风真空干燥，粉碎后装袋贮藏备用。芦丁为标准品，BHT 为标准氧化剂，其它试剂均为分析纯。高速多功能粉碎机、紫外分光光度计、超声波清洗仪、高速冷冻离心机、水循环真空泵。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准工作曲线绘制

准确移取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL 芦丁储备标准液(0.020 00 g·mL-1)于10 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.2 mL 摇匀，静置6 min，再加入10% AlCl3溶液0.2 mL，6 min 后加入4% NaOH 溶液2 mL，混合均匀后用无水乙醇定容至10 mL，显色后用1 cm 的比色皿在波长410 nm 处(以不加芦丁为试剂空白)测定吸光度，然后以吸光度为纵坐标，以浓度为横坐标绘制标准工作曲线，得吸光度A 与芦丁浓度C 的直线方程为A=15.05 C+0.02，相关系数为r=0.999 2。

1.2.2 莲花中总黄酮的提取与含量测定

准确称取1 g 莲花干燥粉末，加入30 mL 70%乙醇溶液，70℃水浴超声恒温回流50 min，抽滤，滤液经11 000 r·min-1高速离心过滤，得莲花总黄酮离心液。离心液用浸提的乙醇溶液定容至50 mL，得样品溶液。按试验方法1.2.1 显色并测定其样品中总黄酮的含量。然后按下式计算样品中总黄酮的提取率。

1.2.3 单因素实验

改变提取条件，考察不同的料液比、乙醇体积分数、提取时间、浸提温度对总黄酮提取率的影响。

1.2.4 响应面法优化莲花总黄酮提取工艺

在单因素实验结果的基础上，确定料液比、乙醇体积分数、提取时间3 个影响较为显著的因素，在固定提取温度为70℃、提取次数为2 次的实验条件下进行3 因素3 水平Box-Behnen 响应面优化实验。响应面法实验设计因素和水平如表1。

表1 响应面设计因素与水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.5 抗氧化性实验

抗氧化性实验参考陈境等[13]的方法进行。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

图1 表示乙醇体积分数对莲花总黄酮提取率的影响。从图1 可以看出，在物料比为1：30，70℃水浴恒温提取30 min 的实验条件下，乙醇体积分数对莲花黄酮提取率有较大影响。当乙醇体积分数为70%时，黄酮提取率为最高13.99%，小于70%时黄酮提取率随乙醇体积分数的增加而大幅度增加，大于70%时黄酮提取率增加不明显，而80%时提取率反而下降，综合考虑选提取莲花总黄酮的最佳乙醇体积分数在70%。

图2 表示不同的温度对莲花黄酮提取率的影响。图2 显示温度在40～65℃内，提取率随温度的升高而大幅度增大，65～80℃区间内趋于平缓，70℃时达到最大。随着温度的升高，分子运动加快，有利于黄酮的浸出。但温度过高乙醇会蒸发，黄酮结构也会被破坏。故选择70℃为最佳浸提温度。

图1 乙醇体积分数对提取率的影响Fig.1 Effect of ethanol volume concentration on extraction rate

图2 温度对莲花黄酮提取率的影响Fig.2 Effect of temperature on extraction rate of flavonoids from lotus

固定物料比为1∶30，乙醇体积分数为70%，在70℃水浴恒温超声回流提取10、30、60、90、120 min，其莲花黄酮提取率随时间变化的情况如图3 所示。从图3 可以发现，随着时间的增长，提取率呈现先增大后减小的显著递进规律，提取率曲线在10～30 min 显著提升，最大值达到13.16%，在30～120 min 时莲花黄酮的提取率呈下降趋势，最低值为9.04%，提取时间过长提取率下降的主要原因可能是因为随着提取时间的增长，莲花中提取的黄酮可能随着溶剂乙醇被蒸发，导致提取率下降。

按实验方法1.2.3 固定乙醇体积分数为70%，水浴温度70℃、超声回流提取时间30 min，将各处理组的物料比变量分别定为1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 时，测定各组提取率数据并绘制图4，观察图4 可知，将莲花粉末物质的量定为1 g，随着溶剂体积的不断增大，提取率一直增大，至溶剂为30 mL 左右时黄酮的提取率基本保持不变，当溶剂体积在30～35 mL 时提取率呈现小幅度的下降。可能的原因是，在一定的物料比范围内，黄酮类物质的溶出速度随着物料比的增加而增大，物料比达到1∶30 以后，黄酮类物质的溶解度和溶出速度达到最大，因此再增加溶剂的量也不会增加其提取率。

图3 时间对提取率的影响Fig.3 Effect of time on extraction rate

图4 物料比对莲花黄酮提取率的影响Fig.4 Effect of material ratio on extraction rate of flavonoids from lotus

2.2 响应面法实验结果与分析

2.2.1 响应面法实验设计与结果

通过单因素实验，选取时间、物料比、乙醇体积分数3 个因素3 个水平的Box-Benhnken 模型进行优化实验，实验设计及结果如表2。

表2 莲花总黄酮提取工艺的响应面实验设计及结果Tab.2 Response surface design with results for extraction of total flavonoids from Lotus

2.2.2 提取工艺条件的响应曲面分析

图5 显示的是多因素交互作用分析结果。从图5 可以看出，乙醇体积分数(A)与物料比(B)、物料比(B)与提取时间(C)之间的相互作用对莲花黄酮提取率的影响较为显著，而乙醇体积分数(A)与提取时间(C)之间的相互作用对莲花黄酮提取率的影响不明显。

图5 乙醇体积分数与料液比、乙醇体积分数与时间和料液比与时间对黄酮提取率的交互作用Fig.5 Interaction of ethanol volume fraction with material-liquid ratio，ethanol volume fraction with time and material-liquid ratio with time on flavonoid extraction rate

2.2.3 响应面回归模型的方差分析

利用Design expert 8.0 软件对表2 试验数据进行方差分析和多元回归拟合方程为Y=13.9+0.9 A+0.042 B+1.03 C+0.17 AB+1.59 AC+0.88 BC-1.16 A2-1.62 B2-3.29 C2回归方程模型方差分析如表3。由表3可知回归模型P＜0.000 1，极显著，失拟项P=0.102 1＞0.05，影响不显著，表明二次回归模型与实际情况拟合较好。R2=0.997 5，表示模型显著，对回归方程中3 个因素分别求导，并另一阶偏导方程等式为0，得出三元一次方程组，解得A、B、C 分别为A=0.619、B=0.134、C=0.324，转换之后可得最优的组合解是乙醇体积分数为70%、物料比为1 :30、时间为29 min，通过回归方程计算，理论上的最大提取率为13.92%。

由表3 可知体积分数、物料比和时间3 个变量因素相互影响互为显著，并对影响莲花黄酮提取率的单因素进行效益排序可得时间＞体积分数＞物料比。

表3 莲花总黄酮提取工艺条件响应曲面回归方程的方差分析Tab.3 Anova of regression equation of response surface for extraction condition of total flavonoids from lotus flower

2.2.4 验证实验

按优化所得的最佳提取工艺进行验证性实验，即采用1 g 莲花干燥粉末，加入30 mL 的70%的乙醇溶液，在70℃下超声水浴回流提取时间29 min 浸提2 次，合并滤液，旋转蒸发得膏状固体，经冷冻干燥后称量，平行5 次实验，得黄酮平均提取率为14.07%。与模型预测值之间相差0.150 0%，重复性较好。

2.2.5 抗氧化性研究结果

由图6 可知，在测定的浓度范围内，莲花总黄酮和BHT 的还原能力随浓度的增加而逐渐增强。当浓度小于0.05 mg·g-1时，莲花总黄酮的抗氧化性略小于BHT；当浓度大于0.05 mg·g-1时，莲花总黄酮明显大于BHT。

图6 莲花总黄酮和BHT 还原Fe3+能力Fig.6 The ability of lotus flaconoids and BHT to reduce Fe3+

3 结论

(1)采用响应面法优化了超声协助乙醇回流提取莲花总黄酮工艺条件，得最佳工艺实验条件为：乙醇体积分数为70%、物料比为1:30、时间为29 min，在此实验条件下提取二次，总黄酮的提取率为14.07%。验证实验结果显示此提取工艺可行性强，重复性好，所用的溶剂可以回收利用，可降低成本，且不会污染环境，能为莲花的综合开发利用提供理论基础。

(2)抗氧化性实验表明，莲花总黄酮还原Fe3+的能力随着其质量浓度的增大而增大，相比BHT，低浓度时比BHT 略低，高浓度时比BHT 强。可见，莲花抗氧化性较好，具有较好的开发价值。