鼻腔定植耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离及其对消毒剂抗性研究

□李旺胜 于凡凡 肖 娜 唐一通

一、材料与方法

(一)菌株来源。试验菌株为收集自108例健康在校大学生鼻拭纸样本(男生65例，女生43例)，所有样本均为来自不同个体的非重复性样本。

(二)实验材料。金黄色葡萄球菌显色培养基(CHROMagarTM法国科玛嘉)，哥伦比亚血琼脂平板，营养肉汤培养基购自广东环凯微生物科技有限公司,Ezup柱式细菌基因组DNA抽取试剂盒，即用Taq PCR扩增试剂盒，扩增引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。试验所用碘伏消毒剂(有效碘0.5%)和75%乙醇购自江西草珊瑚消毒用品有限公司。

(三)试验方法。

1.菌株显色培养与MRSA菌株鉴定。将收集鼻拭纸样本接种至显色培养基，37℃，恒温培养48小时，挑取红色或粉红色菌落保存。并将挑选好的菌落接种至哥伦比亚血琼脂平板，37℃，恒温培养24小时。提取菌株基因组，进行SCCmecA基因PCR扩增，鉴定MRSA菌株。PCR引物为：forward:5’-TCCAGATTACAACTTCACCAGG-3’;Reverse:5’-CCACTTCATATCTTGTAACG-3’。扩增体系为：模板3μl;引物2μl;2×Master mix 10μl; ddH2O 5μl 扩增条件为：95℃ 4min；95℃ 45S，45℃ 45S，72℃ 60S；30循环,72℃ 5min。

2.菌悬液制备。分别取3株MRSA和MSSA菌株接种至营养肉汤培养基，37℃，恒温培养24小时。721型紫外-可见分光光度计分别进行吸光度值(600nm)测定。用肉汤培养基将各菌株所在菌悬液吸光度值调整至0.5 OD备用。

3.MIC测定。肉汤稀释法[1]，用灭菌蒸馏水对各消毒剂母液做系列对倍稀释，取各稀释度消毒液2.5ml加入到双倍浓度营养肉汤试管中，分别接种0.1ml菌悬液作为试验组。以同样方法接种于不含消毒剂的营养肉汤中作阳性对照组；另取3支无菌试管加入灭菌蒸馏水与等量双倍肉汤混合作阴性对照组。将各组接种试管，37℃，恒温培养48小时观察结果。当阳性对照管混浊(有菌生长)，阴性对照管澄清(无菌生长)，试验组无菌生长的最低消毒剂的浓度为MIC值。每个试验菌株各重复3次实验。

二、结果

(一)细菌分离与鉴定。样本中细菌分离鉴定结果显示：108例鼻拭纸样本接种至显色培养基培养，共有44例样本培养出红色(粉红色)菌落，为金黄色葡萄球菌(SAU)所在菌落，SAU检出率40.7%。提取SAU菌株基因组，经SCCmecA基因扩增，有8株扩增出目标条带，确定为MRSA菌株，检出率7.4%。

(二)MIC测定结果。两种消毒剂对MSSA和MRSA菌株的MIC测定结果表明：碘伏消毒剂对MSSA和MRSA菌株的MIC均为312.5mg/L，乙醇消毒剂对MSSA和MRSA菌株的MIC均为46,875mg/L，MRSA菌株和MSSA菌株对两种消毒剂的最小抑菌浓度没有明显差别。

三、讨论

消毒是预防和控制细菌感染的重要措施。研究发现，金黄色葡萄球菌家族携带的qabA/B基因可增强对其消毒剂的耐受性[2]。有报道指出，不同地区分离株各型的肠毒素基因分布存在差异[3]，对评估金黄色葡萄球菌的消毒剂抗性研究有重要意义。纵帅[4]等对徐州地区医院住院患者送检病原学标本分离的MRSA耐药表型和抗消毒剂基因携带情况进行检测，结果显示，MRSA菌株中有28.0%携带抗消毒剂基因qacA/B,MSSA菌株中携带qacA/B基因仅占7.3%。表明MRSA菌株携带抗消毒剂基因比例明显高于MSSA，提示MRSA和MSSA对消毒剂抗性或存在一定差异。林茹等对宁夏地区金黄色葡萄球菌的报道和沈林海等人的研究也有力地支持这一观点[5～6]。也有报道指出，消毒剂对多种细菌的抑菌浓度并无明显差异[7]。国内外研究发现，金黄色葡萄球菌携带的耐消毒基因qacA/B通过表达主动外排多重耐药蛋白，从而介导对消毒剂抗性增加的现象[8～11]。

在校大学生作为典型的社区群体，其携带的金黄色葡萄球菌对常用消毒剂的抗性情况具有代表意义，可以为社区人群针对金黄色葡萄球菌的防控工作提供科学依据。本研究通过对比培养显示，在校大学生群体鼻腔具有一定比例MRSA定植率，其携带MRSA和MSSA菌株对常用消毒剂碘伏和酒精的最小抑菌浓度无明显差异。