天然柿霜上的真菌多样性研究

王天琪，孙晓东，王 辉，关海雯

（大连民族大学 环境与资源学院，辽宁大连116600）

柿饼是一种历史悠久的休闲食品，距今已有1 000多年的历史。北魏贾思勰《齐民要术》中记载：“柿熟时取之，在灰汁燥再三，度干，令汁绝，著器中，经十日可食。”可见柿饼源远流长，直到现在依旧是人们冬季日常生活中的休闲食品，深受消费者青睐。柿饼中富含磷、钙、碘、蛋白质和各类维生素，能有效治疗肠胃不足，解酒毒，压胃热[1]。将成熟柿子去皮后，于日光下晾晒数日，柿子果肉内的成分逐渐外渗，伴随着水分蒸发，在其表面逐渐形成干燥的白色结晶，即柿霜[2]。《本草纲目》中记载：“柿霜乃其津液，生津化痰，清上焦心肺之热，治咽喉口舌疮痛。”可见柿霜对喉痛咽干、口腔炎、肺热咳痰等症有非常显著的疗效[3-4]。柿霜的主要成分是糖类，其形成的过程又是在开放的环境中完成，因此，柿霜中必然蕴藏着丰富的真菌资源。本研究从4个主要柿饼产区陕西富平、桂林恭城、山东临朐、山西运城采集新鲜制成的柿饼12份，采用直接分离和稀释分离2种方法对柿霜上的真菌多样性进行研究，研究结果为评价柿霜的食品安全性及发现功能性菌株奠定研究基础。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

12份柿饼样品分别采自陕西富平、桂林恭城、山东临朐、山西运城4个柿饼产地，每个产地采集3份不同地点的柿饼样品，每份样品0.5 kg。在采集时间上选择刚刚完成制作并未经储藏的柿饼，最大程度上保证了柿饼样品的新鲜程度，之后立即拿回实验室进行真菌的分离和培养。

孟加拉红培养基和PDA培养基由北京陆桥技术股份有限公司提供；真菌基因组DNA快速抽提试剂盒由上海生工生物工程有限公司提供；酵母基因组DNA快速抽提试剂盒由上海生工生物工程有限公司提供；细菌基因组DNA快速抽提试剂盒由上海生工生物工程有限公司提供；其余试剂均为分析纯由天津科密欧化学试剂有限公司提供。

1.2 仪器与设备

奥林帕斯CX21显微镜出自日本奥林帕斯公司；XFH-75C电热式压力蒸汽灭菌锅出自深圳市鼎鑫宜实验设备有限公司；SW-CJ-ID型单人净化工作台出自苏州净化设备有限公司；6-16KS台式高速离心机出自德国SIGMA公司；凝胶成像系统出自美国UVP公司；MG96 PCR仪出自杭州朗基科学仪器有限公司；DY-20D电泳系统出自北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 分离方法和培养基的选择 研究采用了直接分离和稀释分离2种方法。选取孟加拉红培养基为分离培养基，PDA培养基为纯化培养基。

直接分离法：仔细观察柿饼表面，选择不同部位用灭过菌的刀片刮取少量的柿霜置于孟加拉红培养基上，用灭过菌的棉签分散均匀，10℃暗光培养至培养基上长满真菌菌落。每个样品3次重复。

稀释分离法：取2支装有9 mL无菌水的试管，分别编号1、2。用上述同样的方法选取柿饼不同部位刮取柿霜，每个样品的刮取量为1 g。将刮取的柿霜放入1号试管中，使其充分混匀，吸取1 mL溶液放入培养皿中，随后倒入40℃孟加拉红培养基，此时柿霜被稀释了10倍。吸取1 mL 1号试管的溶液倒入2号试管中，混合均匀后吸取1 mL溶液放入培养皿中，随后倒入40℃的孟加拉红培养基，此时柿霜被稀释了100倍。10℃暗光培养至培养基上长满真菌菌落。每个样品3次重复。

1.3.2 菌株的纯化和保存 将长出的单菌落转入PDA培养基上纯化，25℃培养7 d。纯化后的菌株转入30%的甘油小管80℃温度条件下长期保存。

1.3.3 菌株的形态学鉴定 对纯化后的菌株在显微镜下观察形态特征，其中产孢方式、产孢细胞的大小、形态以及孢子的形态、大小、隔膜、表面的纹饰等都是重要的分类依据。菌落特征在鉴定中也可以参考。研究对分离获得的所有丝状真菌都进行了形态学鉴定[5-10]，对无法鉴定到种的菌株、细菌和酵母菌均进行了分子生物学鉴定。

1.3.4 分子生物学鉴定 所有菌株的基因组DNA均采用试剂盒提取，提取后的DNA样品送到上海生工生物工程有限公司进行PCR扩增和扩增产物的测序。采用的引物有ITS（ITS1/ITS4）、16S（27F/1492R）和 NL（NL1/NL4）分别扩增丝状真菌、细菌和酵母菌的特异性区域。测序结果在Genebank里比对，选取相似度为100%的结果，结合形态学特征，确定菌株的分类地位。

2 结果与分析

经形态学和分子生物学鉴定共获得真菌20属30种，研究获得了1株细菌Pseudomonas psychrophila，各样品中的真菌类群详见表1。

由表1可见，Penicillium、Cladosporium、Alternaria，这3个属的真菌几乎存在于所有的样品中，是柿霜上普遍存在的优势类群，而其他种类Rhizopus、Trichoclerma、Fusarium也大量存在于各地的样品中。研究获得了相当数量的酵母菌，其中Metschnikowia、Debaryomyces、Cryptococcus 是 酵 母菌中的优势类群，存在于多地的样品中，采自于山西的样品SX1中同时分到了这3种酵母。Aureobasidium 存在于 SX3、SD2、G3、FZ1 四个样品中，这种菌被报道可以产生普鲁兰多糖、胞外多聚糖类、胞外酶类、黑色素、β-聚苹果酸、嗜铁素、L-山梨醇等一系列物质，这些物质广泛应用于医药、食品、生物防治、化妆品工业和烟草制造工业等众多领域[11]。

从生物量的角度评价，山东和富平的样品分离出的真菌数量要远远小于桂林和山西的样品，而柿霜上物种的多样性桂林是最少的，其他3个地区都拥有相当数量的真菌种类。

研究采用了孟加拉红培养基作为分离培养基，从很大程度上抑制了细菌和放线菌的生长，更好地还原了柿霜中真菌的多样性。unidentified Saccharomycetes是桂林的3个样品中分离得到的几株酵母菌，因为壁厚无法有效地破壁提取基因组DNA，目前无法确定其分类地位。

3 讨 论

本研究发现，柿霜中的真菌丰富多样，以丝状真菌为主，还有很多种类的酵母菌，不同地区的样品都有自己独特的真菌组成。这些真菌中的很多类群都参与了食品的发酵过程，如Rhizopus在酱油、酒曲的发酵中被广泛地应用；Debaryomyces被用于红酒、肉类和奶酪的发酵生产；Penicillium作为重要的发酵功能菌株参与到了奶酪、葡萄糖氧化酶的工业化生产中[12-13]。作为功能性菌株，这些真菌在发酵过程中起的作用至关重要。而存在于柿霜表面的真菌，哪些营腐生生活，哪些参与到了柿霜的形成过程还没有相关的报道，要了解它们的作用还需要进行深入的研究。

表1 样品中检出的真菌种类