油菜蜂花粉及其蜂粮不同溶剂提取物抗氧化活性研究

牛德芳，王波，张静，殷玲，*，刘萍，战旭梅，陈玉勇

（1.江苏农牧科技职业学院，江苏泰州225300；2.黑龙江省蚕业研究所，黑龙江哈尔滨150086）

蜂花粉是指蜜蜂从植物雄蕊采集的花粉粒，经过加入少量花蜜和分泌物混合而成的花粉团状物[1-2]。蜂粮是蜜蜂将采集的蜂花粉储存在巢房内，加入少量的花蜜或蜂蜜，经过微生物发酵而成，是蜜蜂生长和繁衍后代不可或缺的全价营养来源[3-5]。蜂花粉作为一种自然资源，被誉为“微型营养库”，不仅富含酚类、类黄酮、蛋白质、核酸、脂类、维生素、矿物质和微量元素等多种生物活性物质，而且营养物质全面而均衡，且具有低脂肪、高蛋白等特点[6-7]。研究发现，蜂花粉具有抗氧化、抗癌、抗衰老、降低胆固醇和增强机体免疫力等功能，对心脑血管疾病、癌症、肝病、胃肠系统疾病等有很好的预防和改善作用[8-12]。

尽管蜂花粉营养如此丰富，功效如此之多，但是在正常蜂群中蜜蜂一般不直接食用蜂花粉，而是将蜂粮作为主要的营养源，说明蜂粮与蜂花粉相比在某些方面可能更具有优越性。国内外关于蜂粮的研究主要集中在营养成分、不同酿制时间微生物的变化情况以及人工蜂粮的开发利用方面。Loper测定了手采花粉、蜂花粉（杏仁）和7日、21日、42日蜂粮除脂肪酸和胆固醇外的其他营养指标[13]。苏松坤等对中国茶的手采花粉、蜂花粉、不同酿制时间蜂粮中的营养成分和菌落变化进行测定，并获得天然蜂粮的生产方法[14-16]。袁耀东报道了蜂粮的成分和作用[17]。杨多福认为蜂粮具有奇效[18]。Baltrusaityte等测定发现蜂粮样品中酚类物质清除自由基的能力明显高于蜂蜜样品[19]。蜂粮作为一种新型营养保健品所具有的优势逐渐成为共识[20]，并越来越受到人们的重视。但对蜂粮的生物学活性、有效化学成分等基础研究不足，造成了蜂粮开发与利用的严重滞后。已有研究发现蜂花粉具有明显的体外抗氧化功能[21-24]，其发挥作用的主要活性物质包括黄酮类、多酚类、脂类（类胡萝卜素）、维生素C、维生素E等[25-28]，但关于蜂粮体外抗氧化活性的研究尚未有报道。

本文以油菜蜂花粉及其同种植物源的蜂粮为研究对象，首次对油菜蜂花粉及其蜂粮水提物、醇提物体外清除DPPH自由基和ABTS+·的能力进行比较研究，以期获得蜂花粉和蜂粮不同溶剂提取物的体外抗氧化活性，为蜂花粉尤其是蜂粮在抗氧化功能性食品等领域的开发奠定理论基础，对提高蜂粮的综合利用率具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

油菜蜂花粉和油菜蜂粮，取自江苏省泰州养蜂场，-20℃保藏。

1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐[2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS]：美国 Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯或化学纯。

1.2 仪器与设备

T6可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；LABCONCO-6L真空冷冻干燥机：上海照生仪器有限公司；KQ-250B型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；TD5A-WS台式低速大容量离心机：金坛市金南仪器制造有限公司。

1.3 水溶性样品的制备

称取一定质量的油菜蜂花粉和蜂粮样品，按照料液比1∶20（g/mL）的比例加超纯水，40℃条件下超声辅助提取30 min，并以4 000 r/min离心15 min，取上清液50℃条件下进行浓缩后，在真空冷冻干燥机中冻干获得蜂花粉和蜂粮的固体水提物，于4℃冰箱中保存备用。

1.4 醇溶性样品的制备

称取一定质量的油菜蜂花粉和油菜蜂粮样品，按照料液比1∶20（g/mL）的比例加 75%乙醇，40℃条件下超声辅助提取30 min，并以4 000 r/min离心15 min，取上清液50℃条件下进行浓缩后，在真空冷冻干燥机中冻干获得蜂花粉和蜂粮的固体醇提物，于4℃冰箱中保存备用。

1.5 清除DPPH自由基能力的测定

用无水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，置于4℃冰箱避光保存，用时现配。取不同质量浓度的样品提取物溶液和维生素C溶液5 mL（对照组），空白使用对应溶剂，分别加入0.2 mmol/L DPPH溶液5 mL，摇匀后室温避光放置30 min。用75%的乙醇调零，在波长517 nm处测定其吸光度，每个浓度的样品平行操作3次，取其平均值。按式（1）计算DPPH自由基清除率。

式中：A空白是不含提取物空白样品的吸光度；A样品是不同质量浓度样品提取溶液的吸光度。

以提取物质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标，计算回归方程及样品的半抑制质量浓度（IC50）。

1.6 清除ABTS+·能力的测定

ABTS工作液的配置参照王雪飞等的方法[24]。取不同质量浓度的样品提取物溶液和维生素C溶液5 mL（对照组），空白使用对应溶剂，分别加入ABTS工作液5 mL，摇匀后室温避光放置6 min。用超纯水调零，在波长734 nm处测定其吸光度，每个浓度的样品平行操作3次，取其平均值。按式（2）计算ABTS+·的清除率。

式中：A空白是不含提取物空白样品的吸光度；A样品是不同质量浓度样品提取溶液的吸光度。

以提取物质量浓度为横坐标，清除率为纵坐标，计算回归方程及样品的半抑制质量浓度（IC50）。

1.7 数据分析

数据以平均值±标准差表示，统计检验采用SPSS25.0软件，差异显著性水平p＜0.05。

2 结果与分析

根据油菜蜂花粉及其蜂粮的水提物和醇提物体外清除DPPH自由基和ABTS+·的能力，比较其抗氧化活性。

2.1 油菜蜂花粉及其蜂粮水提物和醇取提物对DPPH自由基的清除能力

油菜蜂花粉与蜂粮不同质量浓度水提物和醇提物对DPPH自由基的清除能力如图1所示。

图1 不同质量浓度蜂花粉与蜂粮水提物和醇提物对DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rates of water and ethaonlic extracts from bee pollen and bee bread with various concentrations on DPPH free radicals

由图1可知，各提取物对DPPH自由基均具有一定的清除能力，且清除率与各提取物质量浓度呈正相关性。随着各提取物质量浓度的升高，它们对DPPH自由基的清除率逐渐增大。在各质量浓度下，蜂花粉及其蜂粮醇提物的清除率显著高于水提物（p＜0.05），依次为蜂花粉醇提物＞蜂粮醇提物＞蜂粮水提物＞蜂花粉水提物。在最大质量浓度500 μg/mL时，蜂花粉和蜂粮醇提物的清除率分别为94.2%、73.9%；蜂花粉和蜂粮水提物的清除率分别8.2%和13.4%。

蜂花粉与蜂粮水提物和醇提物清除DPPH自由基的IC50见表1。

表1 蜂花粉与蜂粮水提物和醇提物清除DPPH自由基的IC50Table 1 IC50of water and ethaonlic extracts from bee pollen and bee bread for scavenging DPPH free radicals

由表1可知，蜂花粉及其蜂粮醇提物清除DPPH自由基的IC50值差异不显著（p＞0.05），与其他两种提取物清除DPPH自由基的IC50值差异显著（p＜0.05），4种提取物的抗氧化能力均明显弱于维生素C。蜂花粉醇提物清除DPPH自由基的IC50值最小，为（0.204±0.001）mg/mL，其次是蜂粮醇提物，清除DPPH自由基的 IC50值为（0.290±0.002）mg/mL，二者的清除能力均远强于水提物。蜂花粉及其蜂粮提取物对DPPH自由基清除能力的大小关系为蜂花粉醇提物＞蜂粮醇提物＞蜂粮水提物＞蜂花粉水提物。

2.2 油菜蜂花粉与蜂粮水提物和醇提物对ABTS+.的清除能力

油菜蜂花粉与蜂粮不同浓度水提物和醇提物对ABTS+·的清除能力如图2所示。

图2 不同质量浓度蜂花粉与蜂粮水提物和醇提物对ABTS+.的清除率Fig.2 Scavenging rates of water and ethaonlic extracts from bee pollen and bee bread with various concentrations against ABTS+·radicals

由图2可，各提取物对ABTS+·均具有清除能力，且清除率与各提取物质量浓度呈正相关性。随着各提取物质量浓度的升高，它们对ABTS+·的清除率逐渐增大。在各质量浓度下，蜂花粉和蜂粮醇提物的清除率显著高于水提物（p＜0.05），依次为蜂粮醇提物＞蜂花粉醇提物＞蜂粮水提物＞蜂花粉水提物。在最大质量浓度500 μg/mL时，蜂花粉和蜂粮醇提物的清除率分别为99.5%和100%；蜂花粉和蜂粮水提物的清除率分别20.8%和34.2%。

蜂花粉与蜂粮水提物和醇提物清除ABTS+·的IC50见表2。

表2 蜂花粉与蜂粮水提物和醇提物清除ABTS+·的IC50Table 2 IC50of water and ethaonlic extracts from bee pollen and bee bread for scavenging ABTS+·radicals

由表2可知，蜂花粉及其蜂粮醇提物清除ABTS+·的 IC50值差异不显著（p＞0.05），与水体物清除 ABTS+·的IC50值差异显著（p＜0.05），4种提取物的抗氧化能力均明显弱于维生素C。蜂粮醇提物清除ABTS+·的IC50值最小，为（0.094±0.003）mg/mL，表明其清除 ABTS+.的能力最强；其次是蜂花粉醇提物，清除ABTS+·的IC50值为（0.167±0.003）mg/mL，二者的清除能力均显著强于水提物。蜂花粉及其蜂粮提取物对ABTS+·清除能力的大小关系为蜂粮醇提物＞蜂花粉醇提物＞蜂粮水提物＞蜂花粉水提物。

3 结论

本试验对油菜蜂花粉及其蜂粮水提物和醇提物体外清除DPPH自由基和ABTS+·的能力进行研究。结果显示，4种提取物中对DPPH自由基的清除能力依次为蜂花粉醇提物＞蜂粮醇提物＞蜂粮水提物＞蜂花粉水提物；4种提取物对ABTS+·的清除能力依次为蜂粮醇提物＞蜂花粉醇提物＞蜂粮水提物＞蜂花粉水提物。综上，蜂花粉及其蜂粮醇提物体外清除DPPH自由基和 ABTS+·的能力显著高于水提物（p＞0.05），但 2 种醇提物之间清除自由基的能力差异不显著（p＜0.05），即蜂花粉及其蜂粮醇提物的抗氧化能力显著高于水提物。已有研究表明，油菜蜂花粉醇提物中主要的抗氧化成分是黄酮类化合物和多酚类物质[29-30]，并在体外具有明显的羟基自由基清除功能[21，31-32]。因此，油菜蜂花粉及其蜂粮醇提物的抗氧化性能可能与提物中黄酮类物质和多酚类物质有关，抗氧化能力的大小可能与其含量呈正相关性。蜂花粉水提物的主要活性成分之一是多糖，研究表明红花蜂花粉多糖还具有体外清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的作用[33]。本研究表明，蜂花粉及其蜂粮水提物也具有一定程度的体外清除DPPH和ABTS+·的能力，可能与水提物中的多糖成分有关。综上，蜂花粉及其蜂粮的4种提取物均具有一定的体外抗氧化活性，具有广阔的应用前景，但是分离纯化具体的抗氧化活性因子还需要进一步细致而深入的研究。