超高效液相色谱法同时测定桦褐孔菌中三种主要化合物的含量

张士彦,卢秋霞,贺丽波,孙意冉,罗朝梅,李 玉,黄 磊,唐 琳

(四川大学 a.生命科学学院;b.新能源与低碳技术研究院,四川 成都 610000)

桦褐孔菌[Inonotusobliquus(Fr.)Pilat]属于锈革孔菌科、纤孔菌属的一种民间药用真菌[1,2],广泛分布在美国北部、俄罗斯西伯利亚、日本北海道和我国吉林长白山、黑龙江大兴安岭等地区,从16世纪开始在民间常被用来预防和治疗心血管病、肠胃癌、糖尿病等[3]。桦褐孔菌中除了含有多酚、多糖、萜类、甾体、芳香族化合物,还含有少量的氨基酸、蛋白质、固醇类、色素等生物活性物质[4,5],其中主要的化合物原儿茶醛、丁香酸和(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮具有很好的抗炎[6]、抑制酪氨酸酶[7]、抗菌[8,9]、抗肿瘤[10]等活性,且在其他真菌中均有存在[11-13],因此有必要建立一种快速高效的分析方法对桦褐孔菌进行定量分析,以便对桦褐孔菌的质量进行评价。

高远等[14]采用高效液相色谱(HPLC)法对桦褐孔菌中的麦角甾醇、白桦脂醇、羊毛甾醇、胆甾醇、谷甾醇和豆甾醇进行了定量分析,但存在分离时间长、溶剂消耗大等传统液相色谱共有的缺点[15]。超高效液相色谱(UPLC)作为一种新型的色谱技术,因其简单、快速(几分钟内出峰)、节省溶剂、检出限低、色谱柱耐高压、填充颗粒小、分离效果好的特点,得到了广泛的应用[16-18]。本文首次采用UPLC法对桦褐孔菌中的3种主要成分原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮同时进行了定量分析,旨在为桦褐孔菌的质量评价和资源开发利用提供参考资料。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

分别以产地为黑龙江大兴安岭、吉林长白山、俄罗斯西伯利亚的桦褐孔菌子实体作为实验材料,经四川大学生命科学学院白洁副教授鉴定为桦褐孔菌子实体。

1.2 试剂与仪器

主要试剂:甲醇、乙腈为色谱纯,购置于赛默飞世尔科技(中国)有限公司;其他试剂均为分析纯,购置于成都科龙化工试剂厂;原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮均为本实验室分离纯化得到(纯度≥98%)。

主要仪器:超高效液相色谱仪(UPLC),配备二极管阵列检测器(PDA,美国Waters公司)，SB-300DTY型超声波扫频清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)、MS半微量电子精密分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)、5418R型离心机(德国Eppendorf公司)、HK-UP-IV-20纯水机(成都浩康科技有限公司)、旋转蒸发器RE-52AA(上海亚荣生化仪器厂)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为CORTECS UPLC T3(2.1mm×100mm,1.6μm),流动相A为乙腈,B为0.1%甲酸水溶液,流速0.4mL/min,采用梯度洗脱方法:10%—30% A(0—1.5min),30—42% A(1.5—5min),42—90% A(5—6min),90—10% A(6—6.01min),10% A(6.01—8min);样品室温25℃、柱温40℃;检测波长280nm;进样量1μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮对照品适量,用色谱甲醇分别配制成1.20mg/mL的母液,等体积吸取各对照品溶液混合,即得400μg/mL的混合对照品储备液,备用。

2.3 样品溶液的制备

称取桦褐孔菌子实体粉末1g,加入25mL的95%乙醇,在40℃、59 KHz条件下超声提取20min,重复3次,抽滤,合并滤液,在旋转蒸发器中真空浓缩至干燥,加适量水重悬,按体积比1∶1依次用正己烷(5次)、二氯甲烷(10次)进行萃取,二氯甲烷萃取液减压浓缩至干燥,即得二氯甲烷萃取相。取适量称重,配制成100μg/mL的样品液,0.22μm PTFE微孔滤膜过滤,12000rpm,离心5min,取上清待用。

2.4 线性关系考察

取“2.2”项条件下的混合对照品储备液,将储备液稀释至6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL、0.78125μg/mL、0.390625μg/mL、0.1953125 μg/mL,在“2.1”项色谱条件下,将各浓度混合对照品溶液进行测定,计算峰面积。以各浓度混合对照品溶液中各成分峰面积为纵坐标(Y),以各混合对照品溶液浓度为横坐标(X),制作标准曲线,计算回归方程及线性范围。检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别由信噪比(S/N)为3和10时所对应的样品液浓度表示,结果见表1。

表1 桦褐孔菌中三种化合物线性关系相关参数,LOD和LOQ

2.5 精密度实验

取同一份混合对照品溶液,按照“2.1”项条件,连续进样6次,计算各成分峰面积的RSD,检测其日内精密度;进样3次,连续3天,计算各成分峰面积的RSD,检测其日间精密度。

经日内精密度检测,原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮的峰面积RSD分别为0.422%、0.315%、0.234%;经日间精密度检测,原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮的峰面积RSD分别为1.005%、0.734%、0.397%。RSD均小于2%,说明仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

取同一批次桦褐孔菌子实体粉末6份,按照“2.3”项条件制备样品,进样,计算峰面积,并计算各成分峰面积的RSD,考察方法重复性。经重复性实验检测,原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮的峰面积RSD分别为0.176%、0.174%、0.129%,RSD均小于2%,说明此方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

表2 三种化合物回收率实验

取同一份样品溶液,分别在0、7h、20h、25h、46h、50 h按“2.1”项条件进样,计算峰面积,并计算各成分峰面积的RSD,考察样品的稳定性。经稳定性实验检测,原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮的峰面积RSD分别为2.137%、1.436%、0.940%,RSD均小于3%,说明样品溶液在50h内稳定。

2.8 加样回收实验

取已知浓度的样品溶液,按体积比1:1加入相当于样品浓度50%、100%、150%的混合对照品溶液,按“2.1”项下方法进行测定,计算各成分峰面积,并计算各成分回收率和峰面积的RSD,结果见表2。原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮的平均回收率在95.787%—100.324%范围内,且RSD均小于3%,表明该方法具有良好的准确性。

2.9 样品的测定

取黑龙江大兴安岭、俄罗斯西伯利亚、吉林长白山桦褐孔菌子实体粉末各1g,按“2.3”项下方法制备样品,按“2.1”项下方法进行UPLC检测,计算不同产地各成分含量,结果见表3。混合对照品溶液和桦褐孔菌二氯甲烷萃取相色谱见图1。

表3 不同产地间三种化合物的含量测定

注:1为原儿茶醛;2为丁香酸;3为(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮。

3 结论与讨论

桦褐孔菌作为一种非常有效的民间药用真菌,常用来预防和治疗多种疾病,但此真菌未被列入中国药典,对其质量评价及成分含量测定也缺乏一定的科学依据。本研究考察了CORTECS UPLC T3(2.1mm×100mm,1.6μm),ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm,1.8μm)和ACCQ-TAG ULTRA C18(2.1mm×100mm,1.7μm)三种色谱柱在相同条件下的分离效果,结果表明,CORTECS UPLC T3色谱柱分离效果较好。有文献表明[19],流动相组成、流速、进样量等会影响物质在液相中的分离度,因此本文对色谱条件进行了优化,分别对流动相的组成(甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水)、流动相的比例、流速及进样量进行筛选。结果表明,在流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液、流速0.4 mL/min、进样量1 μL的条件下各物质达到基线分离。含量测定结果显示,不同产地桦褐孔菌中原儿茶醛、丁香酸、(E)-4-(3,4-二羟基苯基)丁-3-烯-2-酮含量差异明显,分析其原因可能是不同产地之间生长环境以及采摘时间不同所导致。在以后的选材中,可选择含量最高的产地的桦褐孔菌作为实验原材料,以便后续的深入研究。

本文所定量的3种主要化合物是本实验室采用高速逆流色谱联合半制备液相色谱法首次分离纯化得到,均其有较好的生物活性,是桦褐孔菌发挥抗炎、抗肿瘤、抗氧化等作用的活性成分[20-23],因此对其进行定量有助于后续对桦褐孔菌活性的研究。传统测定化合物含量的高效液相色谱法和紫外分光光度法分别存在分析时间长、操作繁琐、不能同时测定多种化合物的含量等弊端。本文采用的UPLC法操作简单、高效快速，可同时测定多种化合物的含量,且测定结果准确可靠[24,25]。综上所述,本研究建立的测定3种化合物含量的方法,简单快速、线性关系、重复性良好且准确可靠,可用于桦褐孔菌的质量控制及其开发利用。