鼓室内接种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌构建大鼠鼓室硬化模型

黄玉 刘磊 刘爱国

鼓室硬化是指鼓膜固有层、中耳粘膜下层结缔组织甚或乳突发生透明样变性、钙质沉着或骨化改变，它的形成通常经历炎性渗出、透明样变和钙化形成三个阶段。尽管关于鼓室硬化临床和形态学方面的研究有很多，但其发病机制仍不清楚，通常认为其发病与细菌感染、氧自由基损伤、高钙、一氧化氮、解剖、遗传、免疫、分泌性中耳炎长期置管、骨形态生成蛋白等因素有关[1～7]，临床上多采用手术治疗。

为了探讨鼓室硬化的发病机制，很多研究构建了鼓室硬化的动物模型。大多数研究者通常采用细菌鼓室内注射的方法来构建动物模型，而所选用的细菌通常是肺炎链球菌。由于抗生素的滥用，细菌对抗生素产生耐药性的现象在全球已经变的越来越广泛[8,9]，在引起抗生素抵抗的这些菌种中，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)比较受关注。在皮肤感染、软组织感染、血行感染、医院获得性感染等众多感染的治疗过程中，MRSA都是一个比较棘手的问题。在耳相关疾病中，MRSA感染率已经从0.3%上升到了24.8%[10～13]，因此，本研究选用鼓室内接种MRSA来构建大鼠鼓室硬化模型，旨在探讨该方法的可行性，为鼓室硬化的研究提供一种新的动物造模方法。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 由湖北省实验动物中心提供SPF(specific pathogen free)级雄性SD大鼠34只，体重200 g，经耳科显微镜观察证实外耳道和鼓膜均正常。将34只大鼠随机分为实验组17只和对照组17只。实验组左耳进行鼓室硬化造模，实验组右耳和对照组双耳不予处理。

1.2MRSA悬液制备 由华中科技大学同济医学院附属同济医院检验科实验室提供MRSA菌株。将菌株挑至羊血琼脂平板置于CO2培养箱，37 ℃培养24 h，用无菌生理盐水将菌落调制成浓度为1×108/L的悬液备用。

1.3鼓室硬化动物造模 于实验组SD大鼠腹腔内注射10%的水合氯醛(3.5 ml/kg)进行全身麻醉，将左耳固定朝上，耳科显微镜下充分暴露外耳道和鼓膜。用1 ml注射器抽取0.04 ml浓度为1×108/L的MRSA悬液，于左耳鼓膜前上象限进行鼓室内注射。所有大鼠均未给予任何局部或全身抗感染治疗。

1.4耳显微镜下观察方法和分级标准 分别于造模后第1、2、4、6周，在耳微镜下观察并记录所有存活大鼠双耳鼓膜充血、鼓室积脓和鼓室硬化的程度。鼓膜充血分为4个程度：“-”无鼓膜充血；“+”锤骨柄附近有充血；“++”除了锤骨柄附近充血外，锤骨韧带也有充血；“+++”充血蔓延至整个鼓膜。鼓室积脓分为4个程度：“-”无鼓室积脓；“+”鼓室积脓的体积不超过鼓室腔总体积的25%；“++”鼓室积脓的体积介于25%到50%之间；“+++”鼓室积脓的体积超过鼓室腔总体积的50%[14]。鼓室硬化分为4级：0级，无鼓室钙化灶；1级，鼓膜脐部出现局部钙化灶；2级，除了鼓膜脐部出现钙化灶外，锤骨柄和鼓环也出现钙化灶；3级，钙化灶遍布整个鼓膜[15,16]。

1.5石蜡切片与HE染色 取正常大鼠的左耳听泡及鼓室硬化大鼠的左、右耳听泡，分别经过固定剂固定、乙醇脱水、二甲苯透明，经过透明的听泡在恒温箱中用石蜡和二甲苯进行透蜡(处理3次，每次15分钟)，然后用蜡进行包埋，于包埋听泡的长轴进行多个切片，并做好标注。将做好的石蜡切片依次放入二甲苯和梯度酒精中进行脱蜡，用蒸馏水冲洗后进行苏木素染核、盐酸酒精分化及氨水返蓝，流水冲洗后用伊红染细胞质，蒸馏水洗后放入梯度酒精和二甲苯中脱水透明，晾干后用中性树胶封片，最后进行显微镜观察及图像采集。

2 结果

造模后第1周末，实验组17只大鼠(分别编为1～17号)34耳中有16耳(47.06%，左侧15耳，右侧1耳)成功诱发急性化脓性中耳炎，主要表现为鼓膜穿孔、鼓膜充血和鼓室积脓，无鼓室硬化形成耳(表1)；第2周末，实验组共有16只大鼠存活，2号大鼠因肺部感染死亡，将余下16只大鼠重新编为1～16号，32耳中有16耳(50.0%，左侧13耳，右侧3耳)发生化脓性中耳炎，左侧中4耳发生鼓室硬化(12.5%)，每只大鼠双耳内鼓膜充血、鼓室积脓和鼓室硬化程度见表2。第4周末，实验组共有13只大鼠存活，1号和7号大鼠皆因肺部感染死亡，16号大鼠因麻醉过量死亡，将13只大鼠重新编为1～13号；26耳中有15耳(57.7%，左侧11耳，右侧4耳)发生化脓性中耳炎，有10耳(38.5%)发生鼓室硬化，左耳7耳，右耳3耳；每只大鼠双耳内鼓膜充血、鼓室积脓和鼓室硬化程度见表3。第6周末，实验组共有11只大鼠存活，1号和13号大鼠因肺部感染死亡，将11只大鼠重新编为1～11号；22耳中有1耳(4.5%)存在化脓性中耳炎，有12耳(54.5%)发生鼓室硬化，左耳7耳，右耳5耳；每只大鼠鼓膜充血、鼓室积脓和鼓室硬化程度见表4。

表1 实验组造模后1周耳显微镜观察所见

表2 实验组造模后2周耳显微镜观察所见

表3 实验组造模后4周耳显微镜观察所见

表4 实验组造模后6周耳显微镜观察所见

对照组的17只大鼠中，有2只于第4周末因麻醉过量死亡，余15只大鼠全部存活至造模后第6周，所有对照组大鼠双耳在整个造模观察期间均未发生任何异常改变。

两组耳显微镜下及石蜡切片HE染色观察结果见图1～2。

3 讨论

细菌感染是急、慢性化脓性中耳炎最常见的病因，而Wielinga等[17]于1993年指出，中耳反复的急、慢性炎症刺激及长期的化脓性或浆液性渗出是导致鼓室硬化最重要的病因；另有研究[5]也通过观察发现，慢性化脓性中耳炎有20%～43%有发展成鼓室硬化的倾向。因此，本研究模拟人类鼓室硬化的这一主要病因，给予实验组大鼠鼓室内注射MRSA，诱导其发生化脓性中耳炎，从而构建鼓室硬化模型。从文中结果看，光学显微镜观察实验组HE染色下的中耳组织，可见鼓膜和鼓室粘膜增厚、炎性细胞浸润、胶原纤维增生、细胞间质增多、新血管形成等改变，这些改变与鼓室硬化的形态学改变[17,18]一致。

文中结果显示实验组大鼠造模后1周，绝大多数大鼠左耳均出现不同程度的鼓膜充血和鼓室积脓等急性化脓性中耳炎的表现，造模后2周，已有部分大鼠发生鼓室硬化；随着病程的延长，鼓膜充血消退、鼓室脓液吸收，急性中耳炎的症状逐渐消失，至6周末11只大鼠22耳中已有12耳发展成鼓室硬化，余下未发生鼓室硬化耳趋于愈合，说明本研究所用方法可成功构建大鼠鼓室硬化模型。另外，本实验中，实验组大鼠鼓室硬化不仅发生于注射细菌耳，也可发生于对侧未注射细菌耳，且两侧耳发展成鼓室硬化的过程同步。分析其原因，可能是金黄色葡萄球菌可以产生外毒素，外毒素由MRSA产生后，通过血液循环感染对侧耳，使对侧耳亦发生急性化脓性中耳炎，再通过炎症刺激组织修复，炎症消退，钙质沉着，发生鼓室硬化。

综上所述，鼓室内接种MRSA构建鼓室硬化动物模型的方法切实可行，且与鼓室硬化的临床发病过程极为接近，本研究为探索鼓室硬化的发病机制提供了一种新的鼓室硬化动物造模方法。

图1 实验组和对照组耳科显微镜下观察到的化脓性中耳炎和鼓室硬化不同程度的改变 a.正常鼓膜(左);b.+鼓室积脓(左);c.++鼓室积脓(左);d.++鼓室积脓(右);e.+++鼓室积脓(左);f.+++鼓室积脓(右);g.+++鼓室积脓,伴1级鼓室硬化(右);h.++鼓室积脓,伴2级鼓室硬化(左);i.3级鼓室硬化(左);j.3级鼓室硬化(右)

图2 实验组和对照组鼓膜和鼓室粘膜的形态学改变(HE染色×200) a.正常鼓膜(左),可见层次清晰,结构完整;b.正常鼓室粘膜(左),可见层次清晰,结构完整;c.钙化鼓膜(左),可见鼓膜增厚,炎性细胞浸润,胶原纤维增生;d.钙化鼓室粘膜(左),可见粘膜增厚,炎性细胞浸润,胶原纤维增生,细胞间质增多,新生血管形成(箭头所指);e.钙化鼓膜(右),可见鼓膜增厚,炎性细胞浸润,胶原纤维增生;f.钙化鼓室粘膜(右),可见粘膜增厚,炎性细胞浸润,胶原纤维增生,细胞间质增多