高效液相色谱法同时检测复方紫草油微乳主药成分含量的研究*

梅志辉，许敏，雷群芳，曾嵘

（中南大学湘雅医院 药学部，湖南 长沙 410008）

复方紫草油是一种由紫草、黄芩、白芷等5种中药组成的治疗烧烫伤、疮疡及放射性皮肤损伤的外用复方制剂[1]，具有抗菌抗炎、清除活性氧自由基、促进创面愈合、血管生成等功效[2-5]。君药紫草中含有萘醌类总色素、紫草多糖等化学成分[6]，紫草萘醌和白芷中香豆素类成分极性小，不溶于水，易溶于油。而黄芩的黄酮类有效成分和甘草的甘草酸类有效成分极性大，难溶于植物油[7]。采用麻油作为提取溶剂的传统方法很难将所有有效成分提取出来，因而需寻求一种新的溶剂来同时溶解复方中药制剂中的不同极性成分。微乳对水溶性和脂溶性成分都具有很好的溶解的作用，其作为外用药物载体可增加难溶性成分溶解度，增大皮肤扩散速率[8]，提高药物的生物利用度[9-10]。本研究通过对复方紫草油进行剂型改造，采用一步法制备得到的复方紫草油微乳外观澄清透明、稳定性好，在抗氧化作用、保湿作用及激活酪氨酸酶方面的实验中均取得较好的效果。为建立制剂质量标准，本研究建立一种高效液相色谱方法同时测定复方紫草油微乳中3种有效成分黄芩苷、欧前胡素及紫草素的含量，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1100液相色谱仪（美国安捷伦科技有限公司），AG285型电子分析天平（瑞士Mettler公司），TDZ4-WS低速台式离心机、KS-600超声仪（上海易净超声波仪器有限公司）。

1.2 试剂

对照品黄芩苷（批号：MUST-16022813，中国药品生物制品检定所），欧前胡素（批号：14031710，中国药品生物制品检定所），左旋紫草素（批号：MUST-16041419,中国药品生物制品检定所），乙腈，甲醇（色谱纯），磷酸（分析纯）（国药集团化学试剂有限公司）。水为重蒸馏水，复方紫草油微乳（自制）。

1.3 色谱条件

色谱柱：DiamonsilTMC18 色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0～ 12 min，30% B；12～ 30 min，30% ～54% B ；30～ 45 min，54% B ；45～ 60 min，54% ～85% B）；流速：1.0 ml/min；检测波长：254 nm；柱温：30℃ ；进样量 ：20 μl。

1.4 溶液的制备

1.4.1 对照品混合溶液 取已知浓度 0.691 2 g/L 黄芩苷储备液 5 ml、0.038 6 g/L 欧前胡素 1 ml、0.062 7 g/L紫草素2 ml于10 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液。

1.4.2 供试品溶液精密量 取本品 5 ml，加 20 ml甲醇，振摇、定容至 25 ml，于 3 500 r/min 条件下离心5 min，取上清液经0.45 μm滤膜滤过，即得。

1.4.3 阴性对照溶液 按照复方紫草油微乳处方的比例，分别制备不含黄芩苷、欧前胡素和紫草素的阴性样品，以及不含药物的空白微乳，精密量取2 ml，按照色谱条件进样，记录色谱图。黄芩苷、欧前胡素及紫草素的保留时间分别约为9.3、39.1和41.5 min。阴性样品色谱在与样品中黄芩苷、欧前胡素及紫草素相应的保留时间处无吸收峰。

1.5 方法学试验

1.5.1 专属性试验 分别取对照品混合溶液、阴性对照品、供试品溶液各20 μl，按照色谱条件进样，记录色谱图。

1.5.2 线性试验 分别精密量取对照品 6、12、24、30、36和48 μl，按照色谱条件进样检测峰面积，并以峰面积（Y）对进样量（X）进样回归，得黄芩苷、欧前胡素及紫草素的回归方程。

1.5.3 精密度试验 取对照品混合溶液，按照色谱条件，连续进样6次，计算黄芩苷、欧前胡素及紫草素峰面积的相对标准偏差（RSD）。

1.5.4 重复性试验 同种方法制备复方紫草油微乳样品6份，分别制备供试品溶液，按照色谱条件进样检测，记录峰面积，计算黄芩苷、欧前胡素及紫草素的含量平均值和RSD值。

1.5.5 稳定性试验 取同一供试品溶液 3 份，分别于0、4、6、8、12和24 h，按照色谱条件进样检测1次，检测黄芩苷、欧前胡素及紫草素峰的面积和RSD值。

1.5.6 加样回收试验 取已知含量的样品 6 份，每份0.5 ml，分别加入黄芩苷对照品溶液 1.0 ml，欧前胡素对照品溶液0.3 ml及紫草素对照品溶液0.4 ml，制成供试溶液，按色谱条件进样检测，计算回收率。

1.5.7 样品含量检测 取 3 份同样样品适量，制备供试品溶液并进样检测，计算样品中的黄芩苷、欧前胡素及紫草素的含量。

2 结果

2.1 专属性考察

按照色谱条件进样，记录色谱图。黄芩苷、欧前胡素及紫草素的保留时间分别约为9.3、39.1和41.5 min。阴性样品色谱在与样品中黄芩苷、欧前胡素及紫草素相应的保留时间处无吸收峰。见附图。

2.2 线性试验结果

线性试验得黄芩苷、欧前胡素及紫草素的回归方程见表1。黄芩苷进样量在2.073～16.589μg、欧前胡素进样量在0.023～0.185μg、紫草素进样量在0.081～0.645μg之间呈良好的线性关系。

附图 HPLC色谱图

2.3 精密度

黄芩苷、欧前胡素及紫草素峰面积的RSD分别为0.92%、1.12%和0.79%。结果表明方法的精密度良好。

表1 3种成分的线性关系

2.4 重复性

计算黄芩苷含量平均值为 1954.68mg/ml，RSD为1.98 %；欧前胡素含量平均值为18.75mg/ml，RSD为 1.44 %；紫草素含量平均值为 53.67mg/ml，RSD为0.78%。

2.5 稳定性

24h内黄芩苷、欧前胡素及紫草素峰面积的RSD分别为1.21%、1.50%和1.50%，表明供试品溶液在24h 内稳定。

2.6 加样回收率比较

黄芩苷、欧前胡素及紫草素平均回收率分别为95.79%、99.04%和97.32%，RSD分别为3.23%、3.07%和2.71%，表明该方法回收率良好。见表2。

表2 紫草油微乳中3种成分的回收率 （n=6）

续表2

2.7 样品含量

3份样品含量检测结果见表3。

表3 紫草油微乳中3种成分的含量测定结果 （μg/ml）

3 讨论

文献报道[11-13]用高效液色谱法检测黄芩苷、欧前胡素及紫草素的含量，方法准确可靠，但不能同时进行检测。本研究中发现黄芩苷在280nm波长处有最大吸收，欧前胡素在254nm波长处有最大吸收，紫草素在516nm波长处有较大吸收，但紫草油微乳中欧前胡素含量低，且黄芩苷在254nm波长处也有较强吸收，综合考虑选择254nm波长处为检测波长。当用甲醇作为流动性时，欧前胡素与紫草素峰有干扰，以水作为流动相时黄芩苷解离并未出峰，在酸性条件下黄芩苷解离受到抑制，且对欧前胡素、紫草素的成分检测无影响。最后优选出乙腈-0.1%磷酸溶液可使处方中3个成分的分离效果和峰形较理想。通过试验不同温度25、30和35℃，优选出柱温为30℃。上述方法学研究的系列实验结果证明，建立的高效液相色谱法同时检测黄芩苷、欧前胡素及紫草素有效成分的含量，其待测溶液稳定、精密度高、线性关系良好、回收率符合检测方法的要求，不但节省了分离时间，还能够准确检测各个成分的含量，是一种较理想的含量检测方法，可用于制剂质量控制。