3种抗褐化剂影响水曲柳体胚发生的生理分析

彭春雪 崔雪梅 刘春苹 杨 玲 王秋水 沈海龙

(东北林业大学林学院，林木遗传育种国家重点实验室，哈尔滨 150040)

水曲柳(FraxinusmandshuricaRupr.)是木犀科(Oleaceae)白蜡树属(Fraxinus)高大乔木，温带阔叶红松林重要组成树种、我国珍贵优质阔叶用材树种、北方城乡绿化优良树种，具有重要的经济价值、生态价值和美化价值[1～2]。植物体胚发生既是胚胎细胞生物学和分子生物学研究的全能模型，也是植物种质创新和优良种质材料规模化扩繁的有效系统[3～6]。此外，植物体胚发生可以结合最优无性系个体之间的控制授粉制种及种质的超低温保存和利用，并可以与基因组选择育种相结合，从而直接与良种选育结合在一起，有效提高树木育种效率[6]。因此，系统研究水曲柳体胚发生技术、掌握其生物学机理，对加速水曲柳良种选育和快速规模化繁殖具有重要意义。

目前，水曲柳体胚发生与植株再生培养体系已经建立，并对水曲柳体胚发生过程中的形态解剖、生理生化、DNA甲基化、蛋白质组学等进行了一系列的研究[7～11]。在以前的研究中发现，水曲柳体胚产生过程中伴随着外植体的褐化现象，并且水曲柳体胚大部分都产生在褐化的外植体上[2,9～11]。这与外植体褐化是组织培养不利因素的普遍认知不同，但与以下研究有相同或相似之处：李官德等在棉花(GossypiumhirsutumL.)体胚发生过程中发现的褐化的愈伤组织也能分化出体胚[12]；Tapia等在葡萄(VitisviniferaL.)体胚研究中发现外植体培养到8～14天时发生轻度褐化、但不影响活性和再生能力[13]；Ko等在大豆(Glycinemax(L.) Merr.)体胚研究中发现体胚主要发生在培养中子叶外植体远轴端边缘不断分化和褐化/坏死的组织上[14]；Find等在辐射松(Pinusradiata)研究中合子胚下胚轴和胚根产生的褐色的愈伤组织可以再生出胚性愈伤组织[15]。这些研究结果表明，褐化可能存在某种有利的一面，或者是某种有利因素的一种关联外在表观。因此，我们对外植体褐化与水曲柳体胚发生的关系进行了一系列研究[9～11,16]，以期解析水曲柳体胚发生伴随外植体褐化的生物学机理，为水曲柳体胚高频发生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料与体胚诱导方案

水曲柳种子于2013年11月采自东北林业大学实验林场，去翅后用流水冲洗2 d，在超净工作台中用75%酒精处理30 s，蒸馏水冲洗3～5次，5% NaClO灭菌15 min，最后用无菌蒸馏水冲洗6～7次，将种子的胚轴端切除2～3 mm，挤出胚，将两片子叶内侧贴于培养基上。诱导培养基为MS1/2(将MS培养基中所有成分都减半)附加400 mg·L-1酸水解酪蛋白(CH)，75 g·L-1蔗糖，5 mg·L-1NAA，2 mg·L-1BA，6.5 g·L-1琼脂，调节pH至5.8，接种后暗培养，培养室的温度为25±2℃，培养室的相对湿度为40%～60%。

1.2 抗褐化剂处理

PVP处理浓度分别为0.1，0.5，1.0和2.0 g·L-1；L-Glu处理浓度分别为50，100和200 mg·L-1；AgNO3处理浓度分别为1和10 mg·L-1，共9种处理，以不加任何抗褐化剂处理作为对照组。其中PVP于灭菌前加入培养基中，L-Glu和AgNO3以过滤灭菌形式加入培养基。每个处理重复10次，每个重复接种10个外植体。

1.3 测定指标及方法

在培养过程中，用体视显微镜每天连续观察外植体变化，培养45 d统计体胚发生率及褐化率并对不同处理的外植体进行生理生化指标测定。多酚含量及PPO活性参照刘春苹的方法测定[17]，SOD采用氮蓝四唑光化还原法来测定[18]，POD采用愈创木酚法来测定[10]，MDA采用硫代巴比妥酸反应比色测定法[19]。每项指标均重复测定3次，取平均值。

(1)

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1.4 数据分析

试验数据用Microsoft Office Excel 2007进行统计处理，利用SPSS Statistics 19.0对数据进行方差分析和差异显著性检验，并用Sigmaplot12.5作图。

2 结果与分析

2.1 抗褐化剂处理对水曲柳体胚发生及外植体褐化的影响

PVP、L-Glu和AgNO3的添加显著影响水曲柳体胚发生(P<0.05)，在0.1、0.5 g·L-1PVP和100 mg·L-1L-Glu处理下促进体胚发生，体胚发生率为60.00%、69.85%和69.17%，分别比对照组显著提高了6.59%、24.08%和22.88%，其余处理均显著低于对照组，其中，0.5 g·L-1PVP下体胚发生率最高为69.85%，10 mg·L-1AgNO3下体胚发生率最低为14.83%，相较于对照组降低了74.99%。同样抗褐化剂PVP、L-Glu和AgNO3也显著影响水曲柳外植体的褐化(P<0.05)，只有100 mg·L-1L-Glu处理降低外植体褐化率，其褐化率为68.11%，相较于对照组降低了5.83%，其余处理外植体褐化程度均高于对照组，其中在0.5 g·L-1PVP下褐化率最高，为96.09%，相比对照组提高了32.85%，在10 mg·L-1AgNO3下褐化率最低褐化率是74.66%，相比对照组提高了2.33%(图1)。

图1 抗褐化剂对水曲柳外植体褐化率和体胚发生率的影响 同一测定指标上不同字母表示P<0.05水平差异显著，下同。Fig.1 Effects of antioxidants on explant browning rate and somatic embryogenesisof F.mandshurica Different letters within the same measurement indexindicated the siginificant difference at 5% level,the same as below.

2.2 抗褐化剂处理对水曲柳体胚发生外植体内的多酚含量和PPO活性的影响

PVP、L-Glu和AgNO3添加显著影响外植体细胞内多酚含量(P<0.05)。在0.5 g·L-1PVP、50 mg·L-1L-Glu和100 mg·L-1L-Glu下加剧了多酚含量的积累，其中，在50 mg·L-1L-Glu下多酚含量最高，为0.41%，相较于对照组增加了32.25%，在0.5 g·L-1PVP多酚含量最低，为0.31%，与对照组相同，其余处理均抑制了多酚含量的积累，其中在0.1 g·L-1PVP下，多酚含量为0.15%，相较于对照组降低了51.61%，在10 mg·L-1AgNO3下多酚含量最高，为0.27%，相较于对照组降低了12.90%。PVP、L-Glu和AgNO3添加同样显著影响外植体细胞内PPO活性(P<0.05)，3种抗褐化剂处理后外植体细胞内的PPO活性均低于对照组(图4)。在0.5 mg·L-1PVP浓度处理下，PPO活性最高，与对照组相比下降了30.1%，在1 mg·L-1PVP浓度处理下，PPO活性最低，与对照组相比降低81.2%。从整体角度观察，发现PVP和AgNO3的添加在降低多酚含量积累的同时也抑制POD活性(图2)。

图2 3种抗褐化剂对水曲柳体胚发生外植体多酚含量和PPO活性的影响Fig.2 Effects of three antioxidants on total phenolic content and PPO activity in explants of F.mandshurica somatic embryogenesis

2.3 抗褐化剂处理对水曲柳体胚发生外植体抗氧化酶SOD和POD活性的影响

PVP、L-Glu和AgNO3的添加显著影响外植体细胞内的SOD活性(P<0.05)，3种抗褐化剂的处理中SOD活性均低于对照组，其中，在10 mg·L-1AgNO3下，SOD活性最高，377.59 μg·g-1FW，与对照组相比下降了29.1%，在1.0 mg·L-1PVP下，外植体细胞中的SOD活性最低，58.09 μg·g-1FW与对照组相比降低了80.9%；同时，抗褐化剂PVP、L-Glu和AgNO3的添加显著影响外植体细胞内POD活性(P<0.05)，所有处理的POD活性显著的高于对照组，其中在100 mg·L-1L-Glu下，POD活性最高，为109 473.4 μg·g-1FW，相较于对照组提高了471.8%，在1 mg·L-1AgNO3下，POD活性最低，为36 722.16 μg·g-1FW，相较于对照组提高了110.86%(图3)。

图3 3种抗褐化剂对水曲柳体胚发生外植体中SOD活性和POD活性的影响Fig.3 Effects of three antioxidants onSOD activity and POD activityin explants of F.mandshurica somatic embryogenesis

2.4 抗褐化剂处理对水曲柳体胚发生外植体内的MDA含量的影响

水曲柳体胚发生过程中，PVP、L-Glu和AgNO3添加显著影响外植体细胞内MDA含量(P<0.05)，3种抗褐化剂的处理中外植体细胞内MDA含量均高于对照组。在0.1 g·L-1PVP下外植体细胞内MDA含量最高，与对照组相比提高了131.1%，在1.0 g·L-1PVP下外植体细胞内MDA含量最低，与对照组相比提高了41.5%(图4)。

图4 3种抗褐化剂对水曲柳体胚发生外植体中MDA含量的影响Fig.4 Effects of three antioxidants on MDA content in explants of F.mandshurica somatic embryogenesis

2.5 外植体生理生化指标与体胚发生及褐化的相关性分析

PVP处理后，外植体生理生化指标与体胚发生之间没有显著相关性。然而，外植体褐化率与细胞内的POD活性呈显著正相关(P=0.016<0.05)，与SOD活性呈显著负相关(P=0.043<0.05)与其他指标之间无显著相关性，同时，POD活性与SOD活性呈显著正相关(P=0.029<0.05)。L-Glu处理后，外植体生理指标与体胚发生及褐化之间均无显著相关性，而PPO活性与POD活性呈显著负相关(P=0.032<0.05)。AgNO3处理后，体胚发生率与POD活性呈显著负相关(P=0.042<0.05)，与其他指标相关性较小，褐化率与外植体生理生化指标之间没有显著相关性，而外植体生理生化指标POD活性与MDA含量呈显著正相关(P=0.016<0.05)。

3 讨论

水曲柳体胚产生过程中伴随着外植体的褐化现象[2,9～11]，褐化现象普遍被认为是阻碍组织培养[20]。有研究表明，抗褐化剂的添加能够有效降低外植体褐化率，且在很多植物的褐化研究中取得成效[21～22]。然而，在本研究中发现抗褐化剂PVP、L-Glu和AgNO3的添加并没有降低水曲柳外植体褐化反而进一步加剧褐化现象，这与大多数认知不符，但与以下研究具有相同或相似之处：饶慧云等在葡萄愈伤褐化研究中发现，抗褐化剂硫代硫酸钠(Na2S2O3)的添加，加剧了外植体褐化[23]；Pinto等在蓝桉(EucalyptusglobulusLabill.)体胚诱导的研究中发现抗褐化剂的添加并没有显著降低外植体的褐化能力[15]；陈爱萍等在豆科牧草(Legumeforage)愈伤组织褐化的研究中发现抗褐化剂PVP和柠檬酸的添加加剧了外植体的褐化[24]。结果表明不同种类的抗褐化剂对不同种类植物的抗褐化效果及作用机理存在显著差异，只有选择适合的抗褐化剂才能达到降低褐化的效果。同时，本研究发现低浓度PVP(0.1和0.5 g·L-1)和L-Glu(100 mg·L-1)处理下有利于体胚发生，但其褐化率却显著的高于对照组。叶睿华等在五种抗褐化剂对杜鹃兰(Cremastraappendiculata)原球茎增殖培养的研究中以及刘香江等在抗褐化剂对山葵(Wasabiajaponica)组培苗增殖的研究中均存在相似的现象[20,25]。这表明在水曲柳体胚发生中抗褐化剂的添加在加剧外植体褐化的同时促进体胚发生并不是一个偶然现象，通过相关性分析发现体胚发生与褐化率之间并没有显著的相关性，说明低浓度的抗褐化剂并不是通过改变外植体褐化程度来促进体胚发生。

早期研究表明，外植体细胞内多酚含量和PPO活性与外植体褐化关系密切，并且外植体褐化阻碍组织培养[26～28]。在本研究中发现，在PVP处理下低浓度PVP(0.1和0.5 g·L-1)处理中体胚发生率与多酚含量并没有显著关系，说明低浓度的抗褐化剂并不能通过改变外植体细胞内多酚含量及PPO活性来促进体胚发生。POD通常与脂酶、酸性磷酸酶一起做为组织培养中胚性和器官发生快速灵敏的生理指标[29]，本研究中发现，在PVP(0.1和0.5 g·L-1)处理下POD活性较高。关正君等在樱桃番茄(LycopersivonesculentumMill.)叶体细胞胚发生的研究[30]以及王义等在人参(PanaxginsengC.A.Mey)体细胞胚胎发生的研究中[31]也有相似现象，这说明POD活性促进体胚发生是一个普遍现象，而POD活性加剧促进体胚发生机理可能是在早期体胚发生时，细胞保持较强的分化能力，其物质代谢和呼吸作用都十分旺盛，POD的活性增加可以加快对H2O2的消除，以维持细胞对活性氧的平衡[31]。同时，本研究发现在PVP处理下高体胚发生处理中(0.1和0.5 g·L-1PVP)外植体细胞内MDA含量积累显著高于其它处理，MDA作为膜脂过氧化指标，表示膜脂过氧化程度和对逆境反应的强弱，MDA含量越高，则损伤越大[32～33]，说明水曲柳体胚发生与细胞内活性氧代谢平衡具有一定的联系，但具体机理还需进一步研究。

综上所述，低浓度抗褐化剂(0.1 g·L-1PVP、0.5 g·L-1PVP和100 mg·L-1L-Glu)在促进水曲柳体胚发生的同时加剧了POD活性及MDA含量的积累，这表明水曲柳体胚发生与细胞内活性氧代谢平衡具有一定的联系。因此在未来的研究中，需要进一步探究活性氧代谢与体胚发生之间的调控机理。