申请品种保护的大豆品种常规种SSR位点纯合度分析

赵艳杰 黄思思 冯艳芳 马莹雪 李嫒嫒 张 蝶 邓 超 韩瑞玺 唐 浩

（农业农村部科技发展中心，北京100176）

大豆是我国主要的农作物之一，在新品种保护申请量中占有较大比例。DUS测试（特异性、一致性、稳定性）是植物新品种保护的技术基础和科学依据。一致性是指一个植物品种的特征特性除可以预见的自然变异外，群体内个体间其相关特征或者特性表现一致，是品种内株与株之间的比较。大豆作为自花授粉作物，理论上通过6～7代自交后，品种的纯合度可达到98%以上，但DUS测试经常看到群体内差异明显的现象。据统计，历年来因为一致性不合格未通过授权的大豆品种占到了5.68%。

田间测试具有测试周期长、易受环境影响等特点，因此，研究大豆分子标记纯合度对大豆一致性测试有一定的辅助作用。关荣霞等[1]利用30对SSR引物对2005-2009年参加国家区域试验的1068份大豆品种（系）的位点纯合度进行了分析，年平均纯合度在94.9%～97.6%之间，且纯合度低于85%的品种产量出现不同程度的降低。Guan等[2]用11个SSR标记检测3个大豆品种纯度，杂合位点数分别为1个、9个、10个，说明其中2个品种存在严重混杂。李英慧等[3]在我国2794份大豆资源中检测出纯度较低资源277份，其中16份为育成品种，为有效保存种质遗传完整性提供理论依据。Yan等[4]发现低纯度大豆资源根据表型分离情况可在后代分离出不同的纯系。因此，分子位点的杂合在一定程度上表现出品种的混杂。

本研究对2000-2017年度间申请保护的大豆品种常规种SSR位点纯合度进行系统分析总结，旨在明确我国申请保护的大豆品种常规种SSR位点纯合度状况，分析一致性不合格品种与SSR位点纯合度的关系，为田间一致性测试及选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1试验材料本研究所用材料为2000-2017年度间申请品种保护的661份大豆品种常规种，其种子由农业部植物新品种保藏中心提供。

1.2 DNA提取从每个品种中取50粒种子，放在装有适量湿沙土的发芽盒中，置于人工气候培养箱中培养，待长成苗后，每个样品随机取约20片叶片，液氮研磨后用改良的CTAB法[5]提取DNA。

1.3 SSR标记检测与统计分析荧光引物为黑龙江省农业科学院作物育种研究所推荐的品种区分效果好、峰型易读的40对SSR引物（英潍捷基（上海）贸易有限公司合成）。PCR体系含1×TaqMan®Gene Expression Master Mix、30ngDNA，加 ddH2O 补足20μL。PCR程序为95℃预变性5min，94℃变性45s，60℃退火 45s，72℃延伸 45～90s，运行 32 个循环；72℃延伸10～15min，扩增产物16℃条件下保存。将PCR产物进行适当稀释后，取1μL稀释液加8.5μL去离子甲酰胺、0.5μL Liz-500分子量内标，于ABI 3730 DNA分析仪上进行毛细管电泳检测。利用北京市农林科学院玉米中心开发的SSR指纹分析器采集扩增产物的片段大小。每个品种在各位点的条带单一表示该位点纯合，如果在某位点出现2个及以上条带，表示该位点杂合。SSR位点纯合度=（检测SSR位点数-杂合位点数）/检测SSR位点总数×100%。

2 结果与分析

2.1 不同年度品种SSR位点纯合度变化对661份大豆品种的SSR位点纯合度进行分析，结果表明，2000-2017年度纯合度大于95%的材料共有408份，占供试材料总数的61.725%；纯合度在90.1%～95%之间的材料共有182份，占供试材料总数的27.534%；纯合度在85%～90%之间的材料共有71份，占供试材料总数的10.741%。年平均纯合度在95%～98.1%之间，其中，2002年的平均纯合度最高，为98.1%，2001年最低，为95%。

表1 2000-2017年度检测品种数及SSR位点纯合度

2.2未通过田间一致性测试的大豆材料纯合度分析661份大豆材料中，有8份材料在田间测试中不具备一致性，其中3份材料的纯合度低于85%，4份在87.5%～90%之间，还有1份达到了95%（表2）。大豆常规种田间一致性测试采用至少95%的接受概率，按照这个标准田间一致性测试结果表明：未通过田间一致性测试的材料大部分申请年份在2012年以后，说明在2012年之前，申请者提交的材料不管是自交代数还是样品的纯度都有一定的保证。究其原因，可能是近几年由于申请者出于利益等方面的考虑或者对DUS测试的不理解，导致申请材料在低自交代数或不注重样品纯度就急于申请保护，导致一致性不能通过而被驳回。

表2 未通过田间一致性测试的品种纯合度

3 讨论

植物DUS测试与品种分子纯合度关系密切，品种自身自交代数不够或种子混杂都会导致分子表现不纯合，从而在田间鉴定时出现表型分离，影响一致性测试。张雪原等[6]利用20对SSR核心引物，对10个玉米品种进行了一致性鉴定，结果表明，田间鉴定结果与SSR分子标记鉴定结果相吻合的植株占83%。王俊等[7]对国家资源中期库保存的2个大豆地方品种羊眼豆和毛豆的纯度检测表明，其SSR位点杂合率分别为44.8%和41.2%，单粒种子检测证明这些材料可以被聚为不同的种类，说明SSR位点纯合度可以反映大豆品种的纯度。本研究对2000-2017年度申请保护的661份大豆品种分子纯合度进行分析，发现大豆年平均分子纯合度在95%～98.1%之间，相对较高，整体较好；在未通过一致性测试的8份大豆材料中发现，3份材料的纯合度低于85%，4份在87.5%～90%之间，还有1份达到了95%。说明SSR分子纯合度情况在田间一致性测试上有一定的借鉴意义，但是若要真正判定申请材料是否具备一致性还需通过田间测试。

因此，为防止申请保护材料因纯合度不够影响申请者利益，建议育种家在高世代进行单株选择和繁殖，需提供育种家种子，以确保繁殖材料基因组的纯合度。