毛细管电泳在玉米品种真实性鉴定中的应用

高素伟 张连海 赵新宇

（北京市通州区种子管理站，北京101117）

目前，北京市各区县种子管理站通过田间小区种植来鉴定品种的真实性和纯度，时效性较差，也无法提前避免农民遭受损失。SSR分子标记技术能够对抽检的样品进行快速而准确的检测，保证品种的真实性[1]。毛细管电泳主要应用于肽类、蛋白、核酸、离子和药物等的分离和测定，是以高压电场为动力，以毛细管为通道，依据样品中分子量或碱基逐一分开[2]，可以同时对多个样品、多个标记进行检测，大大提高了检测效率。因此，在现有条件下，利用SSR标记并结合毛细管电泳检测技术对抽检样品进行品种真实性鉴定是提高各区县种子站业务工作能力，确保种子市场安全的有效方法。

本文利用毛细管电泳荧光标记法对本辖区不同门店内抽取的6个玉米样品进行检测，初步判断品种的真实性，对有疑问的样品提交有资质的检验机构做进一步检测。

1 材料与方法

1.1试验材料供试材料为2017年3月份从辖区门店抽取的6份玉米样品，1：金博士郑单958；2：金娃娃郑单 958；3：中字牌郑单 958；4：德农郑单 958；5：纪元1号；6：纪元1号。

1.2 基因组DNA的提取将抽检的6个玉米样品进行田间种植，在3叶期进行取样，每个样品取10个单株叶片，利用TIANGEN的新型植物基因组DNA提取试剂盒，按照操作规程提取DNA，并用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3引物设计参照NY/T 1432-2014《玉米品种鉴定技术规程 SSR标记法》推荐的普通玉米真实性检测基本核心引物P01～P20，分别为bnlg439w1、umc1335y5、umc2007y4、bnlg1940k7、umc2105k3、phi053k2、phi072k4、bnlg2291k4、umc1705w1、bnlg2305k4、bnlg161k8、bnlg1702k1、umc1545y2、umc1125y3、bnlg240k1、phi080k15、phi065k9、umc1492y13、umc1432y6、umc1506k12，引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。其中，P14、P18、P11、P15、P20加ROX标记；P19、P02、P03、P13、P16加TAMRA标记；P09、P05、P01、P12、P10加HEX标记；P08、P17、P07、P06、P04加FAM标记。

1.3 荧光引物PCR扩增荧光引物PCR扩增体系：2×Mix 5μL，10μmol/L 的 F/R 0.1μL，DNA 原液 1μL，加 ddH2O 补足 10μL。荧光引物 PCR 扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，Tm退火30s，72℃延伸 30s，35 个循环；72℃延伸 30min，4℃保存。根据引物退火温度，判断Tm值，其中P12和P13引物Tm值为55℃，其余18对引物Tm值为58℃。

1.4毛细管电泳上机检测取PCR产物0.3μL、分子量内标（LIZ500）0.5μL和去离子甲酰胺 9.5μL混合加入PCR板中，95℃变性5min，4℃冷却后离心，1×Buffer缓冲液上机检测，使用DNA分析仪3500XL的片段分析软件GeneMapper编写panel，读出每个样品每个位点的等位基因扩增片段大小。当样品间差异位点数≥2时，判定为不同；当样品间差异位点数=1时，判定为近似；当样品间差异位点数=0时，判定极近似或相同。

2 结果与分析

2.1 DNA完整性检测结果利用琼脂糖凝胶电泳检测6个玉米样品的基因组DNA（图1），结果显示所有条带均为单一亮带，并且完整、整齐、清楚，而且点样孔清晰可见，没有拖尾现象，表明6个样品的基因组DNA质量较高，没有降解，可以继续下一步试验。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测6个玉米样品基因组DNA完整性的结果

2.2 DNA纯度检测通常用OD260/OD280比值来衡量样品DNA纯度，质量高的DNA，其OD260/OD280的比值在 1.8～2.0之间；OD260/OD280比值 <1.8，表明有蛋白质、酚污染；OD260/OD280比值>2.0，表明有RNA污染[3]。由表1可以看出，6个玉米样品基因组DNA的OD260/OD280在2.0～2.2之间，有少量RNA污染，但毛细管电泳的标记是针对DNA设计的，特异性很高，而且RNA很容易降解，对PCR扩增结果不会有影响，因此可以对扩增产物稀释后进行毛细管电泳上机检测。

表1 6个玉米样品基因组DNA纯度检测结果

2.3 毛细管电泳上机检测结果1、2、3、4号样品20个位点差异位点数=0，不存在差异，说明这4个样品为同一个品种，不存在套牌。由图2可知，5、6号样品的19对核心引物（P05引物没有扩增产物）扩增出来的电泳峰主峰明显、杂峰较少、峰形整齐，分离效果较好，但在P03位点处存在差异，由此判断这2个样品为相似品种，但不能完全确定是否存在套牌[4]。

图2 毛细管电泳检测20对荧光引物在5、6号样品基因组的扩增产物

3 讨论

本试验利用毛细管电泳荧光标记检测技术，对从辖区门店抽检的6个玉米样品进行真实性鉴定，试验结果显示1、2、3、4号样品在20个位点上不存在差异，说明从不同门店抽检的样品不存在套牌，为相同品种郑单958，5号和6号样品均为纪元1号，但在20个位点上存在1个差异位点，该检测结果与所抽检样品不符，但不能完全确定是否存在套牌，为进一步确认可提交有资质的机构做进一步检测[5]。这可能是同一个品种在长期栽培过程中存在自然变异，因此对育种者来说，保持亲本的纯度非常重要，在保存亲本的过程中除了要从形态特征上鉴定外还要从分子水平进行鉴定，以确保生产的杂交种的真实性，保护育种者、生产者及农民的合法权益。