正常肺组织急性重离子照射后基因标志物分析

耿继武，周兆明，山常国，文磊，刘浩，成杰，周美娟，陈龙华，蔡林波，周成

1.广东省职业病防治院/广东省职业病防治重点实验室，广东广州510300；2.广东三九脑科医院肿瘤综合治疗科，广东广州510510；3.南方医科大学公共卫生学院放射医学系，广东广州510515；4.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海200127；5.南方医科大学南方医院放疗科，广东广州510515

前言

质子重离子是经回旋或同步加速器加速产生的带电高能粒子射线（1H、12C），是目前国际上最前沿的放射肿瘤治疗技术［1］。相比常规X线放疗而言，质子重离子具有独特的物理剂量空间分布优势（布拉格峰）［2］以及更强的生物学效能与细胞杀伤效应，比如增加致死性DNA损伤同时减少对于细胞周期和氧合依赖性［3］。得益于这一重要特性，重离子对常规放疗抵抗与乏氧的肿瘤仍然具有较好的治疗效果。在过去20年的临床实践中，以碳离子为基础的重离子放疗已经取得令人欣喜的疗效［4］。在早期非小细胞肺癌中，日本放射线研究所采用重离子放疗已从早期的18次分割放疗逐步减少到9次、4次甚至单次分割治疗即可取得满意的治疗效果［5-7］。

肺是一个放射敏感器官，这一点从广岛、长崎核爆炸幸存者跟踪研究或核设施职业暴露人员出现的肺癌高发病率已得到充分证实［8-9］。常规X线引起的放射性肺损伤，已有大量较为深入的研究和阐述［10-12］。但是和世界范围内高线性能量传递（LET）射线应用不断推广相比，高能粒子射线对于正常组织的生物学效应及毒副作用研究却显得非常缺乏。本研究旨在通过高LET射线辐射诱导小鼠肺组织损伤模型，基于全基因组芯片探讨肺组织受重离子辐射后出现的应激性转录调控，以及潜在的放射敏感基因标志物，从而进一步理解正常组织对高能粒子射线的应激反应机制并寻找可靠的急性期射线暴露生物标志物。

1 材料与方法

1.1 动物实验分组及照射剂量

采用8～10周龄C57BL6雌性小鼠，SPF级饲养。照射前经异氟烷诱导麻醉后，转移至专用小鼠胸部照射装置并妥善固定。采用重离子束进行全肺野照射，肺野置于布拉格峰中间，峰值宽度30 mm。实验动物随机分为空白对照组（12只）和照射组（12只），照射组予以单次12.5 Gy重离子射线照射；空白对照组不接受照射（0 Gy）。于照射后2、24 h分别采用颈椎脱臼法处死小鼠并提取新鲜肺组织，经TRIzol处理后-20℃冻存用于进一步提取mRNA。重离子梯度剂量照射（剂量爬坡）实验共分为7组，分别接受0、7.5、10.5、12.5、14.5、17.5、20.0 Gy重离子全肺野照射。剂量爬坡实验于照射后7 d分别采用颈椎脱臼法处死小鼠并提取新鲜肺组织，经TRIzol处理后-20℃冻存用于进一步提取mRNA。

1.2 基因芯片及数据分析

TRIzol处理肺组织经RNeasy Mini Ki（tQiagen）分离提取总RNA。为了避免DNA污染，用DNase I（Qiagen）处理RNA。纯化的RNA在45.0 μL无核酸酶的水中洗脱，并置于-20℃储存。使用NanoDrop ND-1000分光光度计（PEQlab）评估RNA浓度和纯度。使用2100Bioanalyzer（Agilent）和相应的RNA Nano Chip测定RNA样品的完整性和纯度。基于全基因组基因表达阵列对样品进行分析。使用自带软件包进行表达矩阵的生成、数据注释和处理。在随后的统计测试中，对数据进行log2转换以说明基因的表达上升或者下降。mRNA相对表达量的倍数计算方法：倍数变化（fold-change）=2-ΔΔCt=2-(ΔCt实验组-ΔCt对照组)；ΔCt=Ct待测样品-Ct内参（Ct为反应管中荧光强度达到设定阈值时所经历的循环数）。为分析不同时间点辐射与基因表达趋势关系，采用Rv3.4.4软件包进行supervised与non-supervised聚类分析，包括主成分分析、层次聚类、K均值聚类和自组织映射来识别剂量相关基因表达。敏感基因剂量-效应曲线采用非线性回归拟合分析。

2 结果

小鼠肺组织经重离子12.5 Gy照射后2 h，实验组相比空白对照组显著上调的基因如图1a所示。其中，Trp53inp1（Tumor Protein P53 Inducible Nuclear Protein 1,肿瘤蛋白 P53诱导核蛋白 1）、Phlda3（Pleckstrin Homology-Like Domain FamilyAMember 3,Pleckstrin同源域家庭成员 3）、Ddit4l（DNA Damage Inducible Transcript 4 Like,DNA损伤诱导型转录本4样蛋白）与Gtse1（G2And S-Phase Expressed Protein 1,G2和S期表达蛋白1）4个基因表达最为明显，平均上调2.0～2.2倍（图1b）。基因Sesn2（Sestrin 2,Hypoxia-Induced Gene,缺氧诱导基因）与Bbc3（BCL2 Binding Component 3,BCL2结合成分3）两者次之，平均上调幅度约为1.4倍。其他基因如Mdm2（MDM2 Proto-Oncogene,MDM2原癌基因）、Ptp4a1（Protein Tyrosine Phosphatase Type IVA,Member 1,蛋白酪氨酸磷酸酶IVA型成员1）、Pmaip1（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate Induced Protein 1,PMA诱导蛋白1）以及Osgin1（Oxidative Stress Induced Growth Inhibitor 1,氧化应激诱导生长抑制剂1）也均观察到上调幅度1.1～1.2倍。

图1 小鼠肺组织经重离子12.5 Gy照射后2 h实验组相比对照组显著上调的基因表达变化情况Fig.1 Up-regulated genes of normal lung tissues at 2 hours after 12.5 Gy heavy-ion irradiation vs non-irradiation

上述同一时间点，筛选到的显著下调基因如图2a所示。由图2可见，照射后2 h显著下调的基因相对较少，其中 Wisp2（WNT1 Inducible Signaling Pathway Protein 2,WNT1诱导信号通路蛋白2）与IL33（Interleukin 33,白细胞介素33）基因在照射后2 h明显下调（1.2倍左右）（图 2b）。Dido1（Death Inducer-Obliterator 1,死亡诱导剂-湮灭者1）、Efcab4a（Cracr2b, Calcium Release Activated Channel Regulator 2B,钙释放激活通道调节器2B）、Myo1f（Myosin IF,肌球蛋白IF）仅出现了0.95、0.68、0.65 倍的下调。

重离子射线照射后24 h的结果见图3a，结果显示，Phlda3、Ddit4l基因的平均表达水平相比2 h时间点出现升高，分别达到2.5、2.3倍（图3b）。而Trp53inp1、Gtse1、Sesn2的表达水平比2 h时间点虽出现略微降低，但仍然保持在较高的表达水平（分别是1.50、1.95、1.10倍）。在24 h这一时间点，还观察到一批新的上调基因如Exoc4（Exocyst Complex Component 4,Exocyst复合成分 4）、Ephx1（Epoxide Hydrolase 1,环氧化物水解酶1）、Thyn1（Thymocyte Nuclear Protein 1,胸腺细胞核蛋白 1）、Ei24（EI24,Autophagy Associated Transmembrane Protein,自噬相关跨膜蛋白）分别为1.90、1.80、1.45、1.20倍。在照射后24 h，转录水平下调基因相比2 h明显增多。

图2 小鼠肺组织经重离子12.5 Gy照射后2 h实验组相比对照组显著下调的基因表达变化情况Fig.2 Down-regulated genes of normal lung tissues at 2 hours after 12.5 Gy heavy-ion irradiation vs non-irradiation

图3 小鼠肺组织经重离子12.5 Gy照射后24 h实验组相比对照组显著上调的基因表达变化情况Fig.3 Up-regulated genes of normal lung tissues at 24 h after 12.5 Gy heavy-ion irradiation vs non-irradiation

其中以 Gpihbp1（Glycosylphosphatidylinositol Anchored High Density Lipoprotein Binding Protein 1,糖基磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1）、Sla（Src Like Adaptor,Src类适配体）、Hist1h3ah（Histone Cluster 1 H3A Family Member H,组蛋白簇1 H3A家族成员H）最为显著，分别达到1.60、1.40、1.35倍。Cd2与Stc1基因居其次，分别下调是1.1、0.8倍（图4）。

图4 小鼠肺组织经重离子12.5 Gy照射后24 h实验组相比对照组显著下调的基因表达变化情况Fig.4 Down-regulated genes of normal lung tissues at 24 hours after 12.5 Gy heavy-ion irradiation vs non-irradiation

根据上述对照射后肺组织应激反应期2、24 h两个不同时间点的显著表达基因进行维恩分析后显示，Trp53inp1、Phlda3、Sesn2、Gtse1与Ddit4l这5个基因的mRNA表达水平有助于提示受高能粒子射线辐射后正常肺组织应激反应的潜在基因标志物（图5）。进一步采用重离子梯度剂量照射后7 d的小鼠肺组织进行转录芯片检测，结果表明，由上述5个基因构成的基因组合的表达水平随辐射剂量增加而上调（图6a），并经非线性回归分析获得基于敏感基因平均表达强度的剂量-效应曲线、拟合程度良好（图6b）（adjustedR2=0.60）。

3 讨论

肺癌或其他胸部肿瘤放射治疗引起的放射性肺炎或肺纤维化一直是临床较为关注的问题［13-15］。然而，目前临床上仍缺乏能够用来准确提示与评估治疗过程中正常组织放射性肺损伤的早期基因标志物。在细胞生物学研究中，当细胞受到各种外界条件刺激（如营养缺乏、射线引起DNA损伤、缺氧、温度休克等）后，可迅速出现基因表达的改变从而影响一系列的蛋白质合成［16］。这一细胞在转录水平的重要应激机制，为我们探索正常组织放射性损伤基因标志物提供了崭新的思路。尽管小鼠放射性肺损伤模型长期以来在放射生物学与剂量毒副作用研究中被广泛使用［17］，但这一重要模型在探索高能粒子射线辐射应激反应生物标志物方面尚属首次［18-19］。

图5 维恩图分析显示经重离子照射后应激反应期不同时间点（2、24 h）均显著表达的基因Fig.5 Venn analysis revealed 5 most up-regulated genes at 2 and 24 hours after heavy-ion exposure

本实验采用重离子短期（2、24 h）照射小鼠肺部，并利用基因芯片进行肺部基因表达水平检测，筛查出一系列经过照射后发生显著上调或下调的基因。这些对重离子照射敏感的基因，是潜在提示受照射后短期内转录水平的应激反应的基因。此外，Trp53inp1、Phlda3、Sesn2、Gtse1与Ddit4l这5个基因的mRNA表达水平在梯度剂量重离子照射7 d后均出现显著上调，提示这些基因与高LET射线辐射后肺组织应激反应可能存在一定的关联，可作为潜在的转录水平标志物。今后我们将对这些“潜在标志基因”进行基因表达水平及蛋白表达水平的进一步验证和分析，以排除统计过程或其他原因引起的误差。此外，这些早期显著改变的基因可能与DNA损伤以及修复相关通路有关，但是否与后期肺炎、肺纤维化的发病机制存在一定关联也有待进一步探索。

综上所述，本研究根据照射后应激反应阶段的小鼠肺组织进行全基因组转录水平分析，发现照射后2、24 h不同时间点的辐射相关显著表达基因，有助提示高能粒子射线照射后的正常肺组织转录水平改变。此外，发现Trp53inp1、Phlda3、Sesn2、Gtse1与 Ddit4l这5个基因可作为检测肺组织高LET射线辐射后应激反应的潜在标志物。这些早期辐射敏感基因与DNA损伤修复、放射性肺炎与纤维化之间是否存在病理生理学关联仍有待进一步研究阐述。

图6 接受梯度剂量重离子射线照射后7 d急性期敏感基因组合随重离子剂量升高的表达改变和剂量-效应曲线Fig.6 Expression levels and dose-response curves of 5 selected gene-signatures at the 7thday after dose-escalated heavy-ion irradiation