共焦显微镜在角膜病变中应用的新进展

郑 巧，张 琪

0引言

共焦显微镜(confocal microscopy, CM)检查作为一种“活体组织学检查”方法，以其实时、无创、快速、高清的特点，已在眼科临床及科研中得到广泛应用。其放大倍率可达800倍，分辨率可达1μm，能够从细胞水平对活体角膜组织进行观察，在角膜生理、病理研究及疾病诊断、病情评估、随访等方面显示出优越性。

1共焦显微镜在感染性角膜疾病中的应用

1.1真菌性角膜炎真菌性角膜炎(fungal keratitis, FK)近年发病率呈上升趋势，其病程迁延，是导致角膜盲的常见原因，早期诊断并启动有效的抗真菌治疗是改善其预后的重要因素。角膜刮片镜检及培养是FK诊断的金标准，但丝状真菌生长缓慢，其培养可能需数周，且敏感性低，阳性率不到50%[1]。角膜组织病理学检查及PCR技术已用于诊断FK，但限于其侵入性，难以早期实施。CM可无创、快速的检测角膜中的真菌。CM下真菌菌丝多呈高反光的线型结构，可见分节或分支，呈竹节状或树枝状，丛状杂乱排列。镰刀菌属分支夹角多为90°，曲霉菌属多为45°，据此可做出初步鉴别。孙晓会等[2]对比分析了CM与角膜刮片镜检在FK诊断中的作用，发现CM有更高的阳性诊断率，观察到的菌丝和孢子与角膜刮片检查所见相似，对于病程较长，已使用抗真菌药物或已行病灶刮除等治疗的患者，两者诊断敏感度均下降。有学者就检查者经验在CM诊断FK中的影响做了研究，发现有经验的检查者诊断的平均敏感度为71%，缺乏经验的检查者为43%，所有检查者诊断的特异性为75%或更高，显示检查者经验在CM的诊断准确性中扮演重要角色。目前，CM的分辨率还不能满足对真菌微细结构的观察，无法准确鉴别菌种。近期Chidambaram等[3]使用CM观察不同病原体所致FK的角膜细胞变化，发现前基质星状细胞与镰刀菌性角膜炎相关，树突状细胞与曲霉菌性角膜炎相关，提示角膜细胞的反应可能具有一定特异性，为菌种鉴别提供线索。

1.2棘阿米巴性角膜炎棘阿米巴性角膜炎(acanthamoeba keratitis, AK)由棘阿米巴原虫感染所致，较真菌性角膜炎、细菌性角膜炎等少见，近年隐形眼镜使用的增加使其发病率明显上升，随地区不同，每10000名隐形眼镜配戴者有0.01～1.5名感染棘阿米巴原虫[4-5]。由于早期临床表现缺乏特征性，AK常被误诊为单纯疱疹病毒性角膜炎、细菌性角膜炎或真菌性角膜炎[6-7]。据报道，在培养物中分离出棘阿米巴的概率为0～68%[8]。棘阿米巴有滋养体和包囊两种形态，体积均较大(>10μm),在CM下呈圆形或卵圆形、高反光，易于检出。1992年Chew等[9]首次报道通过CM诊断AK。此后许多研究者研究并肯定了CM对AK的诊断意义，但报道的诊断灵敏度、特异性不一。王玉亭[10]回顾分析了58例AK，发现CM的检出率为86.4%，其中32例根据CM确定的感染范围切除病灶，实施角膜移植术，取得满意效果。据文献报道，棘阿米巴包囊可长期存留于角膜组织中，最长达31mo，角膜炎症控制后仍需药物治疗3～4mo[11]。感染后期角膜上皮愈合，此时可利用CM随访观察，指导治疗。现有研究对棘阿米巴在CM下的表现描述各异。近期Craene等[12]首次参照PCR对CM诊断AK的价值进行了评估并研究了其诊断标准，认为4种影像与AK显著相关：亮点(没有双壁结构的圆形或卵形高反射物)，目标图像(具有低反射光晕的高反射物)，滋养体样图像(直径>30μm，表面呈棘状突起的高反射物)和高反射物体簇。其中目标图像和滋养体样图像诊断特异性最高，为100%，但敏感性最低，分别为8.7%和10.9%，因此需要寻找多方面证据确定诊断。Chidambaram等[3]发现，滋养体样图像可形成簇，尤其在局部类固醇治疗后的病例。Zhang等[13]对29例AK进行观察，发现滋养体样图像的线性或成簇排列与预后不良相关。另有研究者在病程较长的AK中观察到滋养体样图像簇状排列，且比例很高，这些患者曾使用局部类固醇治疗[14]。滋养体样图像的簇状排列是否是AK有用的预后指标还需要更大量的研究确定。这些研究提示，CM可能提供诊断以外的更多信息。

1.3病毒性角膜炎单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis, HSK)是发达国家最常见的感染致盲原因[15]。原发性角膜感染后，单纯疱疹病毒进入三叉神经节，终生潜伏并周期性激活，引起复发性HSK[16]。其严重并发症之一是神经营养性角膜病变[17]。CM虽然无法分辨病毒，但可用于HSK的病理研究。Müller等[18]使用CM观察HSK后角膜瘢痕形成眼及对侧临床未受累眼，发现瘢痕眼角膜内皮细胞密度、总神经长度显著低于健康对照组，对侧眼亦相应降低，两者角膜内皮细胞密度与总神经长度、角膜知觉呈正相关，推测单侧HSK后，双侧角膜神经受损，神经肽水平降低，内皮细胞损失。

2共焦显微镜在变性性角膜疾病中的应用

2.1角膜营养不良角膜营养不良包括一大类与家族遗传有关的原发性进行性角膜疾病，以角膜异常物质沉积为共同特征，表现各异，根据主要受累层次分为上皮和上皮下营养不良、上皮-基质TGFBI营养不良、基质营养不良和内皮营养不良四类。CM是观察CD组织特征的有用工具。Meesmann角膜营养不良主要累及上皮层，表现为上皮囊泡样病变，囊泡突起或破裂后引起眼部不适，可被误诊为干眼。CM下其上皮细胞间存在多量圆形或卵圆形囊泡，大小不一，边界清晰，多呈高反光，内部可含高反光结构，亦可见单独的高反光结构散在于细胞间，在病变区域与正常区域间可见明显的分界[19]。颗粒状角膜营养不良属上皮-基质TGFBI营养不良一类，表现为Bowman 膜下及浅基质层内白色颗粒状物质沉着，逐渐融合成片，形成盘状、雪花状等外观[20]。CM下可见Bowman 膜不规则增厚，反光增强，基质层结构紊乱，出现大片高反光，其间可见短棒状强反光结构。Fuchs角膜内皮营养不良(Fuchs’ endothelial corneal dystrophy，FECD)是较常见的一种CD，相关研究较多。遗传突变和环境触发因素如氧化应激等引起内皮细胞凋亡，异常胶原沉积，后弹力膜增厚，滴状赘疣形成，最终导致角膜水肿和视力下降[21-22]。利用CM对FECD进行分级，与临床主观分级有很好的相关性，CM可作为FECD研究的有用工具[23]。FECD患者角膜基底膜下神经形态异常，敏感性下降。几项研究显示晚期FECD角膜神经减少或缺失，认为其归因于角膜水肿[23-24]。 Aggarwal等[25]通过前瞻性研究发现，FECD大多数神经改变已经存在于早期，伴有树突细胞(dendritic cell, DC)显著增加，显示免疫激活和神经缺失可能参与FECD的发病机制。研究表明，FECD前角膜结构和细胞在早期出现异常，这解释了为什么角膜后弹力层剥除联合深板层内皮移植术(descemet’s stripping endothelial keratoplasty, DSEK)后角膜结构和光学功能不能恢复正常[26]。随着技术进步，更精准的DSEK带来更好的预后，此时宿主角膜早期的亚临床变化与术后视觉结果更加相关。Amin等[27]使用CM观察角膜基质细胞密度、数量及异常上皮下细胞，根据共焦图像光强度分布测量角膜背向散射，发现FECD各期患者的前角膜背向散射升高，基质细胞密度和前10%角膜基质细胞绝对数降低，可见异常上皮下细胞，这些改变在DSEK后持续存在，影响术后视力和视觉质量[28]。对这些变化的深入研究可能有助于揭示FECD的最佳干预时间。

2.2圆锥角膜圆锥角膜是一种双侧性、进行性、角膜扩张性疾病，由于不规则散光或角膜混浊损害视力，晚期常需角膜移植[29]。其病因目前尚不清楚，可能涉及许多因素，包括生化、遗传和环境。早期诊断圆锥角膜有赖于角膜地形图，其通过计算机图像处理系统精确分析整个角膜表面的形态和曲率的变化，诊断灵敏度、特异度高。CM从组织学角度观察角膜，可发现圆锥角膜的早期改变，如后基质层出现褶皱样暗纹、细胞拉长等，与角膜地形图具有良好的互补性。此外，CM在圆锥角膜治疗方法的探索上具有重要价值。角膜胶原交联(corneal collagen cross-linking, CXL)是治疗圆锥角膜的一种成熟技术，已被证明可以减缓或阻止其进展，具有长期的安全性和有效性，为避免紫外线对内皮造成不可逆损伤，常规CXL要求去除上皮后角膜厚度在400μm以上[30]。近年有学者提出，可通过增加功能性角膜厚度来扩展适应证[31]。Mazzotta等[32]对圆锥角膜患者施行隐形眼镜辅助的角膜胶原交联(contact lens assisted collagen cross-linking, CACXL)：将隐形眼镜浸泡于核黄素30min, 在照射紫外线前将其覆盖于角膜表面，以增加功能性角膜厚度至400μm以上。术后使用CM随访观察，术后3mo，患者角膜神经开始再生，到术后6mo，角膜神经完全修复，前基质细胞再生，周围分布致密细胞外基质，水肿消失，随访期内内皮细胞规则，密度无明显改变，显示CACXL可能是薄圆锥角膜安全有效的治疗选择。治疗范围上，国内外学者也做了探索。Cassagne等[33]对比分析了地形图引导的角膜胶原交联(topography-guided CXL, TG-CXL)与常规CXL对进展期圆锥角膜的疗效和安全性。TG-CXL组根据角膜地形图设计紫外线照射部位：以后角膜最高点为中心，包含前角膜异常轴向曲率范围的锥形区域。术后通过CM发现TG-CXL组锥形区域和周围区域间存在一模糊的分界线，周围区域具有更轻微的去神经和细胞凋亡现象，恢复得更快——TG-CXL具有更显著的平坦效应，诱导锥体和周围区域间的生物学梯度，促进神经和细胞恢复，提高视敏度。Mastropasqua等[34]对10例晚期稳定圆锥角膜患者施行飞秒激光辅助的基质透镜植入术，术后以CM观察透镜的存活情况，到术后6mo，透镜内大部分细胞形态趋于正常，呈规则明亮的反光，细胞外组织呈正常的透明性，显示基质透镜已很好的整合于宿主角膜，肯定了该手术方式的有效性。

3共焦显微镜在全身疾病所致角膜病变中的应用

3.1糖尿病周围神经病变糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)是糖尿病的主要长期并发症之一，发病率在50%以上，严重威胁患者生存质量[35]。表皮内神经纤维密度(intra-epidermal nerve fiber density, IENFD)是评估小神经纤维病变的金标准，对早期诊断DPN有重要意义，但有创性限制了其在DPN诊断和研究中的应用。角膜富含末梢神经，是DPN重要受累部位之一。糖尿病患者角膜神经纤维密度下降，与IENFD改变显著相关[36]。研究表明，CM具有与IENFD相当的诊断性能，可检测小神经纤维的早期病变，有良好的重复性，具有快速和无创的优势[37]。近期的一项荟萃分析汇总分析了13项研究，包括1680例受试者，独立证实了角膜神经纤维密度、长度及其分支密度是区分有或没有DPN的糖尿病患者与健康对照者的最佳参数[38]。Lovblom等[39]报道，随访1型糖尿病患者约4a，DPN发生率为17%，基线角膜神经纤维长度小于14.9mm/mm2是发生DPN的最强预测因素。

3.2干燥综合征干燥综合征(Sjögren syndrome, SS)是一类主要累及唾液腺和泪腺的慢性、炎症性、自身免疫性疾病，包括原发性和继发性两类。眼表炎症是干眼的关键事件。Hitomi等[40]利用CM观察发现，SS相关干眼的角结膜炎症细胞密度较非SS相关干眼显著增高。通过CM测量的角膜背向散射已被证明是评估不同临床情况下角膜炎症的有效参数[41-42]。Lanza等[43]报道，原发性干燥综合征相关干眼患者的角膜背向散射较健康对照组显著增高。这些研究均显示SS相关干眼存在更高水平的眼表炎症。

3.3慢性移植物抗宿主病同种异体造血干细胞移植(hematopoietic stem cell tansplantation, HSCT)后，30%～70%的患者发生慢性移植物抗宿主病(chronic graft-vs-host disease, cGVHD)[44]，其中60%～90%累及眼睛[45]。cGVHD眼部病变表现多样，最常见的形式是干眼，发生率为40%～76%[45-46]。He等[47]利用CM观察发现cGVHD相关干眼患者角膜缘上皮DC密度和中央角膜球状免疫细胞密度显着高于无GVHD的HSCT受者，显示cGVHD相关干眼患者眼表面的免疫激活和炎症程度较高，两者可作为cGVHD相关干眼患者眼表损伤和炎症严重程度的可靠指标。Kheirkhah等[48]道，CM下，cGVHD相关干眼的角结膜细胞变化与具有相同疾病严重程度的非GVHD相关干眼患者相似。Tepelus等[49]也观察到两者的CM表现没有显著差异。因此，cGVHD相关干眼的角结膜改变可能只代表了局部疾病严重程度。

综上所述，CM以无创的方式将对角膜的观察深入到微观，提供更加客观、真实的信息，在感染性角膜疾病、变性性角膜疾病及全身疾病所致角膜病变中具有独特的应用价值。然而，随着疾病研究的深入，CM应用越来越广泛的同时，也显现出一些不足：(1)操作相对复杂，学习曲线较长,需要患者良好的配合；(2)重复定位较难；(3)无法准确鉴别病原体及细胞等的种类，无法分辨细菌、病毒等体积更微小的病原体。未来，随着技术进步，操作更简便、定位更准确、分辨率更高的CM将具有更加广阔的应用前景。