脉络膜新生血管基因工程小鼠模型研究

徐晓玮，黎 彪，邵 毅

0引言

脉络膜新生血管形成(choroidal neovascularization，CNV)是许多影响视力的眼部疾病的主要病理特征，同时还与视网膜新生血管形成及二者吻合具有密切关系。CNV动物模型的发展有助于理解这些病症的生物学特性，也可以用于测试新疗法和发展新技术。虽然这些模型概括了CNV在人类中的许多临床表现，但发展的时间、病程进展、病变的大小和外观在不同的模型中各不相同。通常有三种动物模型CNV：激光诱导型、手术诱导模型和基因工程动物。对于前两者的研究已经较为透彻，近年来随着基因工程技术的快速发展，研发出多种不同基因工程动物模型。本综述主要对几种技术成熟、应用最为广泛的基因工程动物模型CNV进行介绍。

1 CNV发病机制

CNV存在于许多脉络膜视网膜疾病[1]，例如年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)、糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)、病理性高度近视和早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)等[2]。理解CNV的病理生物学对于开发适合的动物模型非常重要。CNV代表对特定刺激的非特异性反应[3]。CNV的动态过程(起始、维持和退化阶段)与血管生成、炎症的动态过程和蛋白水解有关[4]。CNV的发展始于Bruch膜的破裂或缺陷，这可能继发于创伤性损伤[5]、退行性病变[6]、组织牵引[7]和(或)炎症[8]。CNV发病机制的关键包括巨噬细胞和视网膜色素上皮巨噬细胞，它们表达的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)在该过程中起重要作用[9]。视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)是脉络膜新生血管形成过程的关键调节作用部位，它表达VEGF、单核细胞趋化蛋白(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)和白细胞介素-8(interleukin-8，IL-8)，调节单核细胞和内皮细胞募集[10]。VEGF是CNV中血管生成的主要引发剂[4]。由VEGF和血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)介导的内皮细胞生长和包绕细胞外基质的周细胞覆盖对于CNV形成是必需的[11]。CNV中涉及几种炎症因子系统，包括补体系统、细胞因子和趋化因子[12]。纤维蛋白充当CNV生长的支架[13]，纤维蛋白由循环纤维蛋白原从组织因子(tissue factor，TF)转化而来。TF细胞受体是促进凝血酶和纤维蛋白两者的丝氨酸蛋白酶的共活化剂。TF也参与炎症、VEGF分泌和细胞黏附[14]过程，需要注意的是：脉络膜新生血管可穿过Bruch膜破口，在视网膜下形成异常新生血管，且二者可以相互吻合[15]。

除了概括人类CNV的病理生物学之外，CNV的动物模型最好能够具备在一定时间内有效且可重复，稳定且可持续，表现出类似人类CNV的包括生长模式在内的病理学特点[3]，生产便宜并能够在体内使用包括荧光素血管造影术(fluorescein angiography，FFA)和光相干断层扫描术(optical coherence tomography，OCT)的成像技术。以下主要介绍CNV基因工程小鼠模型，总结不同基因工程小鼠CNV模型的相关特征，并给出具体的例子，包括它们的优点和缺点。这些模型可以通过引入细胞因子、年龄、饮食和其他因素进行修改。

2 CNV基因工程小鼠模型及其特征

2.1 VEGF164RPE65转基因小鼠虽然有几种ARMD的转基因小鼠模型，但只有相对较少的模型自发形成CNV。很明显，视网膜VEGF或RPE过度表达不足以在这些模型中引起CNV，并且受损的Bruch膜在CNV发展中具有关键作用。该模型的优点是能够通过比较对照和杂交育种实验来研究CNV的各种生物组分。缺点是CNV发展的时长相对较长，发生CNV眼睛的比例相对较小和CNV面积小。该模型支持CNV的最佳模型是引入Bruch膜物理破坏的概念[16]。Schwesinger等[17]描述了一种转基因小鼠表达由RPE65启动子驱动的VEGF。所有的小鼠都形成了组织学上鉴定的脉络膜内血管异常，未突破Bruch膜，被描述为脉络膜新生血管样改变(intrachoroidal neovascularization)，但最终未形成CNV。一些研究者认为该模型中的脉络膜血管异常代表发育(血管发生)改变，而不是新生血管形成。

2.2 Tet/VMD2/VEGF和Tet/VMD2/VEGF/Ang2多重转基因小鼠在一组实验中，Oshima等[18]研究了双重(Tet/VMD2/VEGF)和三重(Tet/VMD2/VEGF/Ang2)转基因小鼠。RPE中VEGF表达增加的成年小鼠具有正常的视网膜和脉络膜，并且不发生CNV。然而，视网膜下注射含有Ang2序列的腺病毒载体导致100%的Tet/VMD2/VEGF小鼠中产生组织学鉴定的CNV，而Tet/VMD2/VEGF/Ang2三重转基因小鼠不自发产生CNV。研究人员使用免疫组化和荧光素葡聚糖灌注平台来证明CNV的存在和大小。该模型提供了VEGF过度表达不足以发展CNV的重要信息；必须有Bruch膜水平的机械损伤和/或其他因素来诱导CNV。在转基因动物中外源性施用四环素或多西环素可抑制目的基因的表达从而影响CNV的发生。需要注意的一点是，应该仔细评估多西环素下调CNV的动物模型。

2.3 Ccr2/Ccl2缺陷小鼠由Ambati等[19]研发的ARMD的Ccr2/Ccl2缺陷小鼠模型已经受到关注。在该模型中，Ccl2或Ccr2缺陷的转基因小鼠不能将巨噬细胞募集到RPE和Bruch膜的区域，导致C5a和IgG的积累，二者均诱导VEGF产生。这些转基因小鼠的组织学、免疫荧光和超微结构(电镜)检查显示，大约25%的小鼠产生了显微镜下可见的CNV。这些发现有助于理解CNV的病理生物学，特别是巨噬细胞募集。虽然CNV的面积非常小，但最近的研究表明CCR3在这些缺陷小鼠CNV内皮细胞中特异性表达。CCR3靶向量子点的体内成像定位了不能通过传统FFA发现的CNV[20]。这是CNV动物模型如何转化为成像和治疗人类CNV的一个很好的例子。

2.4 ApoE过表达小鼠Dithmar等[21]证实了高胆固醇血症小鼠中Bruch膜和RPE区域中的ARMD样改变。Malek等[22]对ApoE4过度表达的转基因小鼠饲喂高脂肪胆固醇饮食，在65～127wk时除了观察到玻璃疣样和基底层状样沉积之外，还发展出CNV。并通过荧光素血管造影、组织学、免疫组织化学和电子显微镜检查发现19%的雄性和18%的雌性小鼠发生CNV。该模型是研究ARMD样病变中自发性CNV形成机制的重要模型。

2.5 Ccl2/Cx3cr1缺陷小鼠Chan等[23]研发了一种Ccl2/Cx3cr1缺陷双敲除(deficient double knockout，DKE)转基因小鼠，在RPE中N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(N-retinylidene-N-retinylethanomalmine，A2E)水平升高，内质网蛋-29(endoplasmic reticulum protein-29，ERp29)水平降低。这些小鼠饲喂低ω-3多不饱和脂肪酸(omega-3 polyunsaturated fatty acids，PUFAs)饮食时，出现了眼底和组织学超微结构可见的RPE变化和玻璃膜疣样病变。该小鼠中的损伤在6wk内发生，在转基因小鼠中时间跨度短，因此成为转基因小鼠自发性新生血管形成中具有潜在吸引力的模型。

2.6 SOD1-/-老化小鼠Imamura等[24]研究了Cu-Zn-超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD1)缺陷小鼠的视网膜、RPE、Bruch膜和脉络膜区域的眼底、FA、组织学、超微结构和免疫组织化学特征发现，这些SOD1-/-老化小鼠分别有8.3%和10%存在CNV的眼底和组织学证据。在老化SOD1-/-小鼠的RPE中检测到氧化损伤DNA的标志物8-羟基-2’-2-脱氧鸟苷(I-OHdG)，但在对照中未检测到。相对于12月龄的小鼠而言，16月龄小鼠的视网膜血管与脉络膜下新生血管相吻合。

2.7 Vldlr-/-定向突变小鼠该小鼠为针对极低密度脂蛋白受体基因(VldlrTm1Her)的靶向突变的纯合子小鼠。3mo后小鼠在视网膜外丛状层和脉络膜吻合区域形成新的血管[25]。如后文提及的自发性16号染色体Bst突变小鼠一样，这些特征似乎与视网膜血管瘤性增生病变(retinal angiomatous hyperplasia，RAP)相似。

2.8视紫红质启动子/VEGF过度表达小鼠Okamoto等[26]和Tobe等[27]研发了视紫红质启动子/VEGF融合基因转基因小鼠。这些小鼠的后代与C57BL/6小鼠杂交发展成FFA可见的视网膜内新生血管形成，延伸到视网膜下。该损伤与RAP相似，表明VEGF在视网膜中的过度表达足以引起视网膜内和视网膜下新生血管生成。新生血管形成可能起源于动物的脉络膜和视网膜，从而导致脉络膜-视网膜吻合。该小鼠模型可以用于评估新的CNV治疗方法。

2.9自发性16号染色体Bst突变小鼠Smith等[28]已经深入研究了自发性16号染色体Bst基因突变小鼠的眼部组织病理学。眼底检查发现，该小鼠自发形成了视网膜损伤。自发性腹部斑点和尾巴(Bst)突变出现在C57BLKS近交系小鼠中。通过眼底检查、FFA和组织学研究，发现大约88%的小鼠发生组织学上确定的视网膜下新生血管。新生血管形成与RPE异常、视网膜错构瘤样病变以及Bruch膜缺陷引起的视网膜和脉络膜新生血管吻合有关。尽管新生血管形成与年龄有关，但在这种小鼠中没有玻璃疣样或基底层类沉积样损伤，因此相比于ARMD中的CNV，新生血管的形成更类似于RAP。

2.10 Cp-/-Heph-/Y敲除小鼠Hahn等[29]证明在转基因小鼠中，铁质过氧化氢酶和辅助蛋白的破坏导致了铁的过量。转基因小鼠的血浆铜蓝蛋白和膜铁转运蛋白辅助蛋白破坏导致铁超载引起ARMD样改变。这些小鼠产生RPE变化和光感受器变性。尽管脉络膜和视网膜新生血管生成并不明显，但小鼠在RPE水平发生明显的病变，且100%的小鼠发生了组织学上确定的视网膜下新生血管。此外，这些小鼠不像ARMD那样发展出玻璃疣状或基底层状(类)沉积样病变。

3总结与展望

总之，成功的CNV动物模型所需的三个特征：(1)VEGF引起的持续性血管生成；(2)炎性细胞因子组分；(3)Bruch膜受损[30]。迄今为止的研究模型表明，VEGF过度表达不足以引起CNV的发展；需要以机械或生物学方式造成Bruch膜的损伤以诱导CNV。Bruch膜在人CNV的形成中起中心作用。所有模型都需要Bruch膜受损、VEGF表达和炎性细胞因子等因素介导。这也强调了在CNV形成中起主要作用的因素取决于模型。一些模型具有由视网膜或RPE特异性启动子驱动的VEGF过度表达的转基因动物过度表达VEGF。还有模型强调了巨噬细胞募集作用的关键性。利用CNV动物模型实验时，研究者应该了解CNV形成中各种因素(如对Bruch膜的机械损伤、VEGF产生、炎性细胞因子介导)的相对重要性。没有绝对理想的CNV动物模型，每种现有基因工程小鼠CNV模型都有优点和缺点。选择动物模型时的注意事项与模型的用途有关。在决定使用哪种动物模型的CNV时，给定的实验室的能力，包括预算、动物培养设施和实验目标都非常重要。