脂褐素与年龄相关性黄斑变性

罗茂梅，蔡善君

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是发达国家55岁以上人群的主要致盲原因，其病因被认为是由多种因素引起的，包括持续氧化应激、慢性炎症、遗传和环境易感因素等[1]。ARMD的患者数以百万计，并且可能随着人口寿命的延长而增加[2]。ARMD能影响患者黄斑，导致中心视力丧失，严重影响患者的阅读、看电视或驾车的能力[3]。大约90% ARMD患者病程缓慢进展，称为干性ARMD，特点是进行性色素上皮萎缩，然而该疾病可以转变为更严重的形式，称为湿性ARMD，特点是脉络膜新生血管，引起一系列出血、渗出和瘢痕改变，它是ARMD导致视力丧失的主要因素。导致ARMD发展以及从干性向湿性转变的机制尚不清楚，虽然这种疾病的治疗方案越来越多，但是目前还没有有效的治疗方法。脂褐素(有时称为“老化色素”)是细胞内的荧光色素颗粒，主要积聚在有丝分裂后细胞，如神经元细胞、心肌细胞和视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞[4]。脂褐素随着年龄增长而缓慢积累，一般来说它是氧化的蛋白质、脂质、碳水化合物、金属(主要是铁)和其他有机分子的混合物，但是这种混合物因来源的组织而异[5]。脂褐素对细胞功能的作用目前还不清楚，但人们普遍认为，脂褐素的积累会增加机体对氧化应激的易感性，降低溶酶体的降解能力，RPE细胞中脂褐素随着年龄增长的聚积也被认为是ARMD的主要危险因素。

1脂褐素的形成与组成

脂褐素随着年龄的增长而逐渐积累，是在多种病理生理条件下形成的，如氧化应激和老化，其基本特征是蛋白质损伤和清除之间的不平衡，导致蛋白质内稳态失调，氧化蛋白质聚集体积累，随后高交联材料如脂褐素和类脂褐素脂质体积累，影响细胞活力[6]。因此，脂褐素被看作是吞噬和自噬过程中未被消化的细胞物质的聚集体，作为内质颗粒堆积[6]。在RPE中形成的脂褐素主要来源于RPE细胞吞噬光感受器外段脱落的膜盘，被吞噬的膜盘在溶酶体内未被完全消化，残留物便聚积形成脂褐素。正常人视网膜后极部脂褐素浓度最高，中央凹脂褐素含量最少，维持终身不变，这与视网膜的局部功能和视杆细胞分布是相对应的[7]。在一位80岁患者的RPE细胞中脂褐素约占细胞体积的19%。导致脂褐素积累的增加可能与光照、RPE65以及基因突变致ABCR活性减低有关。光照会引起全反式视黄醛释放过多的脂褐素前体，而光感受器间的视黄醇结合蛋白可以在视杆外段清除全反式视黄醇和视黄醛，防止脂褐素前体的形成，但不能去除已经存在的前体。据报道，溶酶体酸化可以防止ARMD患者受损的RPE细胞堆积脂褐素[8]；Hohn等[9]认为自噬体和溶酶体并非强制性地参与脂褐素形成，而是充当此类生物分子聚集的储存场所，从而有助于减轻其细胞毒性；Ureshino等[10]发现细胞内脂褐素积累会损害巨噬细胞的自噬能力。最新研究表明脂褐素形成可以发生在溶酶体室外，并且独立于巨噬细胞吞噬过程，这是由于在衰老过程中有丝分裂和自噬普遍减少，但脂褐素的形成却仍然增加，线粒体裂变的抑制和线粒体蛋白质的持续氧化是年龄相关的脂褐素形成的重要因素[11]。

从RPE脂褐素中分离出的第一个化合物是N-亚视黄基-N-视黄基乙醇胺(A2E)，它是脂褐素的主要成分，属于类视黄醇家族，通过NADPH氧化酶催化产生超氧化物而具有毒性，导致RPE细胞死亡[12]。A2E具有特殊的楔型结构，由一个独特的吡啶极性头基团和两个疏水的维甲酸尾组成，因此不易被溶酶体酶识别难于被降解。A2E的生物合成是一种多步骤过程：包括视锥和视杆细胞吸收光，产生全反式视黄醛，两分子全反式视黄醛与一分子乙醇胺反应形成N-亚视黄基-N-视黄基-磷脂酰乙醇胺(A2PE-H2)，然后A2PE-H2被氧化为A2PE，它是A2E的直接前体，当光感受器脱落的膜盘被RPE细胞吞噬后，在溶酶体内酶切形成A2E[13]。视循环过程中产生过多的11-顺式视黄醛也可在视杆细胞中直接形成A2PE[14]。由于光感受器外段的完全替换约10d，A2PE便不连续地积累在感光细胞，因此防止A2PE的积累有助于外段膜的不断更新。A2E可被体外合成且已广泛用于研究，探讨其参与视网膜随着老化而发生的破坏性过程。A2E大致分布规律在远周最高，向中心下降[13]。

2 RPE细胞脂褐素的自发荧光特性

RPE细胞聚集的脂褐素是眼底自发荧光的来源，其成分复杂，含有20多个荧光团，主要是类视色素二聚体及其光氧化和光降解产物[15]。在人视网膜组织切片中记录RPE脂褐素荧光，发现其信号从黄斑中央凹向周围增加，在距中心凹8°处达到高峰后，向周边减少[16]。眼底中央凹自发荧光少的主要原因黄斑色素对激发光的吸收和RPE中心有高密度的黑色素。脂褐素颗粒中荧光团的组成可随年龄或病理改变而变化，进而可导致眼底自发荧光光谱特征的改变[17-18]。事实上，眼底自发荧光的光谱光度测量表明，65岁时的荧光比25岁时的荧光强2.8倍，但自发荧光在70岁以后会下降，可能是由于RPE细胞随年龄减少，另一个促成因素可能是A2E光氧化相关的荧光下降。由于RPE脂褐素的自发荧光色素是由全反式视黄醛产生的，所以当11顺式和全反式视黄醛发色团不能通过视循坏产生时，比如在与RPE65突变相关的早发性视网膜营养不良中，将不存在眼底自发荧光[19-20]。此外，通过眼底荧光成像对RPE脂褐素的体内监测已经证明，RPE显示出强烈自发荧光的区域容易萎缩，自发荧光增加的病灶区域是进展为ARMD的危险因素。眼底自发荧光激发光谱在490～510nm(体内)和590～630nm(体外)达到峰值[21]，RPE脂褐素激发光谱在590～600nm达到峰值[22]。眼底自体荧光的光谱特征与RPE脂褐素的光谱特征一致，当被逐渐变长的波长激发时，整个脂褐素记录的发射光谱显示出红移[23]。有研究表明脂A2E在眼底自发总荧光强度中并不占优势，A2E的氧化形式比A2E本身具有更强的荧光，A2E对眼底自发总荧光强度的贡献不大[18,23]。Tatiana等发现在不同激发波长和发射波长下，A2E和iso-A2E的荧光强度明显低于其他荧光团[18]。

3 RPE脂褐素引起ARMD的可能机制

3.1 RPE脂褐素对细胞的影响在体内，局部脂褐素含量与邻近感光细胞的损伤直接相关，表现出对RPE细胞的毒性[24]。超过一定浓度的A2E或脂褐素能破坏RPE的细胞膜、从线粒体分离促凋亡蛋白、损害溶酶体功能(抑制溶酶体质子泵、碱化溶酶体并增加溶酶体内胆固醇含量而抑制吞噬功能)等，造成RPE损伤[25]，这些可能与A2E的特殊结构有关，A2E的两亲性结构导致其能聚集、诱导洗涤剂样膜完整性丧失、溶解单层膜的脂质双层并引发膜泡起泡。而Cheng等[26]发现A2E在破坏线粒体膜方面特有效，可能是由于带负电荷的线粒体膜和带正电荷的A2E分子之间有很好的相互作用。Wang等[27]认为A2E的光氧化会引起DNA损伤，包括端粒去保护作用，进一步加速RPE细胞的衰老，并导致旁分泌效应，影响整个视网膜环境，从而可能导致视网膜变性。脂褐素还被证明可与氧化还原活性的金属比如铁结合，产生活性氧，诱导细胞凋亡，脂褐素导致细胞损伤和细胞毒性的程度似乎与脂褐素本身存在的铁浓度密切相关[11,28]。Parmar等[29]利用诱导多能干细胞来源的RPE细胞与10μmol/L的A2E共培养，发现与时间成正比的细胞死亡数的增多，并出现血管内皮生长因子上调和26种前体炎性因子上调，促进脉络膜新生血管的形成，引起视网膜炎症，导致RPE细胞损伤。一些研究表明，A2E本身并不会引起RPE细胞死亡，反而可刺激RPE细胞自噬，防止损伤细胞的积累[30-31]，自噬在保护RPE免受氧化应激和脂褐素积累中起着重要作用，但当自噬能力随着脂褐素积累的增加而下降时，可加速ROS生成和蛋白聚集，激活炎症反应，进一步诱发RPE长期的炎症、加速老化过程、细胞变性，最终可导致细胞死亡[32]。脂褐素还有一个重要特征是它能通过竞争性结合蛋白水解酶抑制氧化蛋白降解，包括20S蛋白酶体和溶酶体蛋白酶，导致脂褐素的进一步积累，增强它的细胞毒性[6]。

3.2 RPE脂褐素的光氧化随着年龄的增长，RPE细胞中光氧化和光降解产物水平的增加尤其可能增加ARMD的风险。Zareba等[33]发现原代培养人RPE细胞的光损伤程度与其内源性脂褐素含量成正比。Kim等在分离的人和小鼠视网膜色素上皮中检测到A2E和全反式视黄醛二聚体的光氧化形式，提出光氧化在眼睛中是一个持续的过程[24]。对RPE脂褐素和单个脂褐素荧光团(如全反式视黄醛二聚体和A2E)的研究表明，这些化合物是单线态氧和超氧化物阴离子等活性氧的光诱导发生器[34-35]。用蓝光对人RPE分离的脂褐素颗粒进行有氧光活化，可产生单线态氧、超氧阴离子和过氧化氢等大量氧自由基[36]，引发细胞膜功能异常、溶酶体和抗氧化酶失活，尤其是A2E在蓝光激发下形成有害的A2E-环氧化物能加速活性氧产生，引发RPE细胞损伤[34]。RPE脂褐素的光毒性在体外研究中也得到证实，在人RPE细胞培养基中预载脂褐素颗粒，暴露于390～550nm光下，脂褐素光敏细胞表现出明显的形态学改变，溶酶体完整性丧失，脂质过氧化增强，存活率显著降低[37]。Magdalena等首次证实人RPE脂褐素颗粒诱导的光氧化会损伤RPE细胞的特异性吞噬活性，抗氧化剂具有中和脂褐素产生活性氧的作用[38]，证实了活性氧以及氧化应激在ARMD发生过程中的重要性。

A2E和全反式视黄醛二聚体光氧化后能刺激补体激活[39]，还可导致Abca4突变小鼠的Bruch膜增厚和光感受器细胞变性[40]。Yamamoto等[41]观察到灵长类动物体内RPE脂褐素荧光下降，这可能是由于脂褐素有光氧化和光降解的倾向。在任何给定时间，眼底自发荧光的强度可能是荧光团合成与RPE中脂褐素光氧化/光降解不同步的结果。在视网膜血管的阴影下，由视黄醛(11-顺式转换为全反式视黄醛)形成的脂褐素可继续有增无减，但脂褐素光氧化将显著减少[14,42]，因此视网膜易位比如视网膜脱离时会显示出更强烈的自体荧光的血管印记。

3.3其他脂褐素色素的积累是正常RPE的特征，但是在Abca4基因突变相关的视网膜疾病(比如隐性Stargardt病)中特别丰富，20～29岁的Stargardt患者的自发荧光强度甚至比60～69岁的正常人高2倍，Abca4中某些突变的致病杂合体也表现出对ARMD的易感性增加[43]。RPE脂褐素的光氧化产物还可激活补体，引起慢性炎症过程，逐渐使黄斑患病，因此补体激活未被充分调节也被认为是与ARMD易感性的基础[44]。此外，视网膜下小胶质细胞中脂褐素随年龄增加而积累，能促进炎症和补体激活与沉积，进而驱动ARMD病理过程中视网膜外免疫失调[45]。载脂蛋白B随年龄增长沉积在Bruch膜中形成脂质壁，与上述产生的活性氧作用产生炎性过氧化脂质，引发新生血管，从而参与玻璃膜疣的形成，玻璃膜疣是ARMD特有的富含脂质的细胞外病变。

4小结

虽然RPE脂褐素是引发ARMD的主要因素这一观点尚未得到证实，但脂褐素参与ARMD病因学的证据不容忽视，越来越多的迹象表明RPE脂褐素过度积累可导致细胞功能障碍，并导致视网膜老化和退化。因此我们应努力了解ARMD发生发展过程中RPE脂褐素所起的作用，以及与其他因素之间的可能联系，从而为ARMD的预防与治疗提供巨大帮助。