miRNA通过转录因子及EMT相关调控蛋白在胃癌侵袭转移中的作用机制研究

毛竹君，祝利民，卢艳琳，王俊军，周浩，沈克平#

1上海市中医药大学附属龙华医院肿瘤科，上海 200233

2上海市青浦区中医医院内科，上海 201400

微小RNA（microRNA，miRNA）是一种短链非编码RNA，参与调节人类30%以上编码蛋白质的基因的表达[1]，在肿瘤发生中可能起促癌或抑癌作用。miRNA的表达与胃癌及其他肿瘤的发生发展密切相关，并在肿瘤相关基因的调节中起重要作用[2]。

研究发现，miRNA的表达与胃癌患者的生存期有关，胃癌组织miRNA-9和miRNA-137表达水平升高与胃癌的TNM分期较晚、局部淋巴结转移和生存期较短有关，并以CUL4A为靶基因参与胃癌上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的生物学过程[3]。另一项研究采用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）检测miRNA-124在88例胃癌患者中的表达水平，结果发现miRNA-124的表达与胃癌患者的总生存期（overall survival，OS）密切相关[4]。研究显示，miRNA-345的表达下调与胃癌患者局部淋巴结转移和较晚的TNM分期密切相关，miRNA-345的表达水平降低可缩短胃癌患者的OS和无病生存期（diseasefree interval，DFS）[5]。胃癌组织中miRNA-599的表达水平降低，常提示预后较差，与淋巴结转移和较晚的TNM分期有关。研究显示，miRNA-599可以预测胃癌患者的5年生存率，预测价值较高[6]。miRNA参与胃癌发生发展生物学过程的具体机制值得深入研究。

EMT不仅可参与正常胚胎发育过程中器官和组织的生成过程，也可促进肿瘤细胞的迁移和侵袭，EMT可使肿瘤细胞的间充质表型发生改变，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭[7]。研究显示，部分转录因子、生长因子及相关信号通路均可参与EMT过程[8]，而miRNA可通过调控原癌基因或抑癌基因来调控胃癌细胞的EMT过程。EMT是胃癌细胞侵袭和转移的关键步骤，snail、扭曲蛋白（TWIST）和E盒结合锌指蛋白（zinc finger E-box binding homeobox，ZEB）等转录因子及其他EMT相关作用蛋白的上游靶基因均可能作为预测肿瘤迁移和侵袭的分子标志物。机体发育过程可调控EMT的生物学过程，而机体的发育过程又受到TWIST1、ZEB等一系列转录因子的调控，这些转录因子又是EMT过程的重要调控因子[9-10]，均可抑制E-钙黏蛋白（E-cadherin）的表达，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。miRNA通过与靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）的3'非翻译区（3'-untranslated region，3'-UTR）特异性结合，促使mRNA降解或抑制其翻译，从而在转录后调节靶基因的表达水平。上述机制共同调控胃癌EMT的整个过程。本文就近年来miRNA与胃癌转录因子及EMT相关调控蛋白间的关系，及其参与肿瘤迁移和侵袭的分子机制进行综述。

1 miRNA与转录因子snail

snail是重要的EMT转录因子，通过与E-pal盒（包含启动子的2个毗邻E盒）结合来抑制E-cadherin蛋白的转录，从而影响EMT过程，snail过表达与胃癌淋巴结转移相关[10]，并可作为预测胃癌疾病进展及预后的独立标志物。miRNA-491-5p可以抑制多种肿瘤的发生发展，其过表达可明显抑制胃癌EMT过程和肿瘤细胞的侵袭转移[11]。snail被认为是miRNA-491-5p的目的基因，此外，miRNA-491-5p还可抑制成纤维细胞生长因子4（fibroblast growth factor 4，FGFR4）的转录，从而间接下调snail蛋白的表达并抑制胃癌EMT过程。miRNA-30a可与snail基因的3'-UTR结合，并抑制其表达。研究发现，miRNA-30a可能通过靶向调控snail蛋白的表达影响胃癌的EMT过程，从而影响胃癌肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，此外，miRNA-124、miRNA-506、miRNA-204及miRNA-203等也被证实具有类似作用[12-15]。

2 miRNA与转录因子TWIST

TWIST是碱性螺旋-环-螺旋（basic helix-loophelix，bHLH）转录因子家族成员，包括TWIST1和TWIST2两种类型，均可参与EMT过程，在胃癌肿瘤细胞的迁移和侵袭过程具有重要作用[16]。胃癌细胞和动物模型实验中均证实，TWIST1能诱导EMT，促进肿瘤侵袭和转移，miRNA-495过表达可明显影响肿瘤细胞的存活和迁移能力，促进细胞凋亡并抑制EMT过程，TWIST1是miRNA-495的目的基因，TWIST1沉默后可部分逆转miRNA-495对胃癌肿瘤细胞EMT过程的抑制作用[17]。miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p也可影响TWIST1的表达和EMT过程。生物信息学分析表明，TWIST1的3'-UTR含有miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p两个结合位点，miRNA-15a-3p和miRNA-16-1-3p过表达可以抑制TWIST1基因3'-UTR的荧光素酶活性，下调N-钙黏蛋白（N-cadherin）、α-平滑肌肌动蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）和纤维蛋白等EMT相关蛋白的表达，抑制基质金属蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）的活性，从而抑制胃癌细胞的迁移和侵袭[18]。

3 miRNA与转录因子ZEB

ZEB包括ZEBl和ZEB2两种类型，二者结构相似，由中间的可变序列将C端和N端的锌指簇连接起来。C端和N端的锌指簇能与DNA分子上的CACCT（G）或（C）AGGTG序列结合，从而抑制其下游EMT相关蛋白的靶基因转录[19]。此外，ZEB蛋白还具有Smad结合域和羧基末端结合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）相互作用结构域。研究显示，ZEB蛋白过表达与肿瘤的发生和转移密切相关[20]，目前已有研究证实，胃癌组织中存在ZEB的过表达。ZEB通过下调E-cadherin的表达，上调间质表型标志物[波形蛋白（vimentin）、纤维粘连蛋白（fibronectin，FN）和N-cadherin]和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的表达，诱导肿瘤细胞发生EMT，促进肿瘤细胞转移。一般情况下，miRNA-338-3p在胃癌中过表达，其通过ZEB2调控蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）通道抑制胃癌的EMT过程，沉默miRNA-338-3p可引起胃癌细胞表型变化，从而调控N-cadherin、FN和vimentin等EMT相关蛋白的表达[21]。ZEB2作为钙调蛋白的转录抑制因子，miRNA-145-5p可通过抑制N-cadherin及目的基因ZEB2的表达来抑制胃癌细胞的侵袭和转移，调控胃癌EMT过程[22]。研究显示，miRNA-200b过表达可以改变胃癌细胞的形态，下调ZEB2mRNA的表达，同时上调钙调蛋白的表达；此外，miRNA-200b过表达还可以明显降低肿瘤细胞增殖率，抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭[23]。

4 miRNA与转录因子FOX

叉头框（forkhead box，FOX）基因家族，是一个庞大且功能广泛的转录因子家族，其共同特征是具有一个高度保守的叉头结构域。研究表明，叉头框M1（forkhead box M1，FOXMl）蛋白通过调控间充质细胞标志物（ZEBl、ZEB2、snail和Vimentin）的表达来调控胃癌细胞的EMT过程[24]。体外实验表明，miRNA-345在胃癌组织中低表达，可抑制胃癌细胞的EMT过程，而沉默FOXQ1可以逆转miRNA-345对EMT的抑制作用，FOXQ1被证实是miRNA-345的下游信号蛋白[5]。miRNA-1271在胃癌组织中的表达下调，且miRNA-1271的表达与肿瘤直径呈负相关，与局部淋巴结转移和较晚的TNM分期密切相关。miRNA-1271过表达可明显抑制胃癌细胞增殖及EMT过程。敲除FOXQ1可以抑制胃癌细胞的恶性转化，而下调miRNA-1271的表达可促进FOXQ1表达的恢复，因此，FOXQ1被认为是miRNA-1271的直接目的基因[25]。此外，miRNA-194在胃癌组织中表达明显下调，其过表达可以抑制胃癌细胞侵袭和转移，并调控胃癌细胞的EMT表型，miRNA-194可以参与FOXM1转录后的调控机制[26]。

5 miRNA与其他转录因子

SP1在胃癌EMT过程中发挥重要作用，在胃癌组织中表达水平明显高于正常组织[27]。miRNA-223与SP1基因的3'-UTR结合并抑制其翻译，采用肿瘤生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导胃癌细胞，成功地建立了细胞EMT模型，miRNA-223过表达可以促进胃癌EMT相关蛋白的表达并抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，从而诱导肿瘤细胞凋亡，SP1基因可以特异性调控miRNA-223/SP1/EMT信号通路抑制胃癌EMT过程[28]。胰岛素样生长因子受体1（insulin-like growth factor receptor 1，IGF1R）致癌基因，是一种细胞生长的重要调节因子，通常在胃癌中过表达并诱导胃癌细胞的EMT过程，与胃癌细胞的侵袭和转移有关。IGF1R是miRNA-7的直接目的基因，与miRNA-7的表达呈负相关。此外，miRNA-7还可通过调控IGF1R的表达，上调钙调蛋白的表达，部分逆转胃癌EMT的过程。研究显示，miRNA-7/IGF1R/snail信号通路可抑制胃癌细胞侵袭和转移[29]。胃癌组织中miRNA-148a低表达与淋巴结转移有关，miRNA-148过表达可通过下调vimentin的表达和上调钙调蛋白的表达来抑制胃癌细胞的转移，其目的基因是转录因子SMAD2[30]。血清应答因子（serum response factor，SRF）也可以调控胃癌细胞侵袭和转移。研究显示，SRF在侵袭能力较高的胃癌细胞中表达水平较高，并与胃癌患者的不良预后密切相关。SRF/miRNA-199a-5p/钙调蛋白通路可促进胃癌细胞EMT过程并提高其转移能力[31]。miRNA-144-3p在胃癌组织中的表达明显下调，且miRNA-144-3p的表达水平与肿瘤的浸润深度、肿瘤直径、淋巴结转移和TNM分期有关。B淋巴细胞白血病转录因子3（pre-B-cell leukemia transcription factor 3，PBX3）可促进胃癌细胞的EMT过程，是miRNA-144-3p的直接目的基因。

6 小结

随着生物技术的不断发展和人们对miRNA认识的不断加深，越来越多miRNA的生物学功能被发现。部分研究证实，miRNA具有作为胃癌治疗靶点的潜在价值，但其在胃癌发生发展中的作用机制仍未十分明确，尚需进一步利用miRNA模拟物或拮抗物进行更多的体内外研究证实。了解miRNA调控相应靶基因的作用机制，并据此对肿瘤细胞进行基因或药物靶向治疗，可以促使miRNA或靶基因的异常表达恢复至正常水平，或降低其异常表达水平，提高胃癌的诊断、治疗水平，改善预后。