骨肉瘤多药耐药性相关机制研究进展△

丁万军，曾涛综述，戈伟审校

1武汉大学人民医院肿瘤中心，武汉 430060

2武汉大学人民医院东院内分泌科，武汉 430000

骨肉瘤是儿童和青少年较常见的一种恶性骨肿瘤，其主要发病部位为股骨远端和胫骨近端，多数患者在15～19岁发病[1]。截肢术曾是骨肉瘤的标准治疗术式，但患者术后5年的生存率不足20%[2]。随着肿瘤化疗技术的不断发展，化疗联合保肢手术成为临床治疗骨肉瘤的重要手段，可使患者的5年生存率提高至66%～82%[3-4]。然而部分骨肉瘤患者因多药耐药（multidrug resistance，MDR）而对化疗不敏感，从而导致治疗失败，这也是影响骨肉瘤患者预后的主要原因之一[5]。MDR是指对一种化疗药物具有耐药性的同时，对其他性质不同、作用机制不同的肿瘤化疗药物也具有耐药性[6]。MDR可导致新辅助化疗失败或晚期挽救性化疗失败，最终导致骨肉瘤患者因肿瘤复发或广泛转移而死亡。

在过去的30年间，骨肉瘤的整体治疗效果停滞不前，其主要原因为骨肉瘤的化疗疗效无明显提高。MDR是骨肉瘤化疗面临的主要难题，也是骨肉瘤患者治疗成功与否的重要因素[5]。因此，迫切需要进一步全面了解骨肉瘤的MDR机制，寻找新的逆转MDR的治疗方案，以进一步改善患者的预后。目前研究表明，MDR的发生与多种机制有关，如药物排出增加、细胞解毒作用增强、细胞凋亡抑制、DNA损伤修复增强、骨肉瘤干细胞相关化疗耐药、自噬相关化疗抵抗、长链非编码RNA异常。本文将针对以上7个方面对骨肉瘤化疗MDR机制的相关研究作一综述。

1 药物排出增加

1.1 三磷酸腺苷结合盒诱导的肿瘤MDR

肿瘤的MDR机制研究较早，其中了解最清楚的是P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）的药物泵作用。1976年，Juliano和Ling[7]首先在对秋水仙碱耐药的中国仓鼠卵巢细胞中发现起药物泵作用的P-gp是导致耐药的主要因素，并由此提出了跨膜运输理论。随后，Kartner等[8]于1985年克隆出编码P-gp的多药耐药基因1（multi-drug resistance gene 1，MDR1）。之后研究证实，P-gp在包括骨肉瘤在内的多种人类恶性肿瘤的MDR中具有重要意义。药物泵作用导致的MDR理论被称为经典MDR。

P-gp是三磷酸腺苷结合盒（adenosine triphosphate binding cassette，ABC）转运蛋白超家族成员，由MDR1基因编码。ABC转运蛋白超家族成员包括P-gp、多药耐药相关蛋白1（multidrug resistanceassociated protein 1，MRP1/ABCC1）、多药耐药相关蛋 白2（multidrugresistance-associated protein 2，MRP2/ABCC2）及乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP/ABCG2）。P-gp是ABC转运蛋白超家族中发现最早的一种蛋白，也是目前研究最广泛和最深入的蛋白。P-gp为广谱药物外排泵，可以通过促进化疗药物的外排，增强肿瘤的化疗抵抗能力。通过细胞膜上的药物泵P-gp非特异性地将化疗药物排出是多种肿瘤细胞内药物积聚减少的机制之一[9-10]。相关研究发现，P-gp的高表达与人类骨肉瘤细胞系的MDR相关[11-13]。一项对26例骨肉瘤患者的回顾性研究表明，核因子-κB（nuclear factor of kappa B，NF-κB）及P-gp过表达与骨肉瘤的化疗耐药有关[14]；而另一项对60例骨肉瘤患者的临床试验发现，ABCC2与化疗反应有关[15]。此外，还研究表明，P-gp过表达与肿瘤进展有关，P-gp过表达骨肉瘤患者的肿瘤复发率和转移率均较P-gp低表达骨肉瘤患者明显增高[14,16-17]。

相关研究表明，ABC转运蛋白超家族中的其他成员，如多药耐药相关蛋白（multidrug resistance protein，MRP）、BCRP等同样也参与了肿瘤细胞耐药的过程[12-13]。Chen等[3]研究发现了MRP1在线粒体膜上的表达及其外排活性。

1.2 还原的叶酸载体诱导的MDR

除了增加化疗药物的细胞外排，减少化疗药物的细胞内流入也是导致骨肉瘤耐药的重要机制之一。甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）是骨肉瘤的常用化疗药物之一，该类药物进入细胞时需要经过细胞膜上还原叶酸载体蛋白（reduced folate carrier，RFC）的载运。当细胞膜上RFC的表达水平降低时，细胞内MTX的浓度也随之降低，表明细胞膜上RFC的表达水平降低与MTX耐药有关。Matherly等[18]对人骨肉瘤活检样本进行研究发现，与RFC表达水平高的骨肉瘤患者相比，RFC表达水平低的骨肉瘤患者对化疗的敏感度较低。

2 细胞解毒作用

肿瘤细胞的耐药还与细胞的解毒功能有关。关于细胞的解毒功能，目前研究最多的是谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase，GST）。GST的解毒作用是肿瘤细胞产生MDR的重要机制之一。GST是同源二聚体酶超基因家族成员，有θ、μ、α、π等多种同工酶，其N端谷胱甘肽（glutathione，GSH）的结合位点含有酪氨酸残基，酪氨酸残基羟基可以与硫醇化GSH形成氢键，在催化反应中有重要作用；其C端为亲电子结合区，为底物结合位点[19]。GST-π与人类肿瘤耐药的关系最密切，GST-π可以催化GSH的巯基，使其能与多种体内或体外来源的亲电化合物结合形成极性较大的复合物，而该类复合物可以被MRP、P-gp等泵出体外，从而实现GST-π的解毒作用。但同时，大多数化疗药物也可以被GST-π催化，与GSH结合形成GSH-药物复合物而被MRP泵出体外，从而使抗肿瘤药物在体内的作用时间缩短，不能够有效发挥抗肿瘤作用，导致临床上发生严重的肿瘤细胞MDR[20]。GST-π不仅可以通过直接影响肿瘤细胞的解毒功能，还可以通过抑制丝裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MARK）通路来抑制肿瘤细胞凋亡，最终导致肿瘤细胞耐药[21]。

相关研究表明，上调谷胱甘肽S-转移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1）的表达，激活胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）及抑制c-Jun氨基端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）的磷酸化，均能够降低骨肉瘤细胞对多柔比星和顺铂的化疗敏感度[22]。还有研究发现，GSTP1过表达骨肉瘤患者的术前化疗疗效较GSTP1低表达患者差[23]。Townsend和Tew[21]研究发现，化疗可以诱导GSTP1蛋白表达上调，而GSTP1高表达与骨肉瘤患者的预后不良有关。

3 细胞凋亡抑制

诱导细胞凋亡是化疗药物根除肿瘤细胞的主要机制之一，因此细胞凋亡的异常改变是MDR的重要机制。

3.1 Bcl- 2基因及其表达产物

Bcl-2基因是与细胞凋亡关系密切的原癌基因之一，主要编码抗凋亡蛋白[如B细胞淋巴瘤/白血病-2（B-cell lymphoma/leukemia 2，Bcl-2）、B 细胞淋巴瘤/白血病-xL（B-cell lymphoma/leukemia xL，BclxL）]和促凋亡蛋白[如Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，BAX）、Bcl-2拮抗物（Bcl-2 antagonist/killer，BAK）、Bcl-xL/Bcl-2相关死亡启动因子（Bcl-xL/Bcl-2 associateddeath promoter，BAD）]，其中与骨肉瘤化疗耐药相关的产物为Bcl-2蛋白和BAX蛋白，两种蛋白的作用相反，分别通过抑制或促进线粒体释放细胞色素C来调控细胞凋亡。目前，关于Bcl-2蛋白和BAX蛋白对骨肉瘤化疗敏感性的作用仍存在争议。但有研究认为，BAX/Bcl-2蛋白表达率增高与骨肉瘤患者的4年生存率和无瘤生存率降低有关[24]，表明Bcl-2蛋白介导的细胞凋亡可能与骨肉瘤患者的总生存有关；另外，Bcl-2蛋白活性可能与骨肉瘤的组织学恶性程度有关，Bcl-2蛋白活性越高，骨肉瘤的组织学恶性程度越高。Bcl-2的表达也被证明与骨肉瘤患者的预后密切相关[25]。

3.2 p53基因

p53基因是一种抑癌基因，是细胞生长、增殖的负调节因子，对细胞周期及细胞凋亡的调控起关键作用。突变型p53基因失去了对细胞增殖的监控作用，反而可以促进细胞的增殖、转化及癌变[26]。既往研究显示，p53基因突变可能与骨肉瘤细胞MDR相关。如孙丽梅等[27]在对260例原发性乳腺癌患者手术切除标本的研究中发现，突变型p53蛋白的阳性表达与GST-π的阳性表达呈正相关，提示突变型p53蛋白可能通过促进GST-π蛋白的表达，导致乳腺癌MDR。Tsuchiya等[28]对骨肉瘤细胞系的研究发现，转染野生型p53基因的骨肉瘤细胞对顺铂的敏感度较转染突变型p53基因的骨肉瘤细胞提高2倍。有研究表明，p53基因突变的骨肉瘤患者的术前化疗敏感性差于p53基因未突变的患者；同样，也有一些研究表明，p53突变型骨肉瘤患者的总生存情况较对照组患者差，表明p53表达可能是骨肉瘤患者的预后因素[29-30]。另外，Wunder等[31]研究发现，与p53低表达组比较，p53过度表达组骨肉瘤患者的化疗后组织学反应差（≤90%坏死）。此外，还有研究表明，在骨肉瘤中p53基因突变可能与MDR1基因表达增加有关，后者可以促进P-gp的表达，最终导致患者预后不良[32]。

3.3 微小RNA

微小RNA（micro RNA，miRNA）是一系列进化保守内源性非编码RNA，是由20～25个核苷酸组成的单链RNA分子。miRNA与靶基因信使RNA（messenger RNA，mRNA）的不完全互补配对，可以负性调控靶基因的表达，抑制靶基因编码的蛋白质的翻译表达过程，促使mRNA降解。与编码基因相比，miRNA更加稳定，而且单个miRNA可以同时调控多个蛋白质编码基因及多条肿瘤相关的分子通路，因而miRNA调控机制复杂而多样化。多项研究表明，miRNA与肿瘤的发生、发展及耐药紧密相关[33-35]。因此，miRNA将可能作为预测肿瘤患者化疗敏感性的生物标志物，并可能成为逆转肿瘤MDR的靶点之一。

相关研究表明，miRNA-140可以通过抑制组蛋白脱乙酰酶4（histone deacetylase 4，HDAC4）使骨肉瘤细胞的G1期和G2期阻滞，从而抑制骨肉瘤细胞增殖，导致化疗耐药[33]。Song等[34]研究表明，miRNA-215可以通过抑制DTL蛋白的表达，使人骨肉瘤细胞阻滞于G2期，抑制人骨肉瘤细胞的增殖，增强人骨肉瘤细胞对MTX和雷替曲塞（TDX）的耐药性。关于骨肉瘤的研究表明，miRNA-30a在对多柔比星耐药的骨肉瘤细胞中呈低表达；而下调miRNA-30a表达则可以激活Bcl-1基因，诱导细胞自噬，从而促进骨肉瘤细胞对多柔比星耐药[35]。

4 DNA损伤修复

治疗骨肉瘤的化疗药物包括环磷酰胺和顺铂，该两种药物可以引起DNA损伤，从而导致细胞死亡。因此，MDR相关的机制之一为骨肉瘤细胞DNA损伤修复能力的增强。一般情况下，细胞主要通过以下4种机制对DNA损伤进行修复：碱基切除修复（base excision repair，BER）、双键断裂修复（double strand break repair，DSBR）、错配修复（mismatch repair，MMR）、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）[36]。BER、NER 和 DSBR功能的异常增强与抗肿瘤药物耐药性呈正相关，MMR则对抗肿瘤药物耐药起负向调控的作用，提示DNA修复功能异常与肿瘤耐药之间的关系十分复杂[37]。

作为DNA损伤修复的主要途径之一，BER催化的底物范围非常广泛（如烷化剂、电离辐射和类辐射药物等导致的单链断裂以及铂类药物等形成的单功能DNA加合物等），因此BER功能异常与抗肿瘤药物耐药关系密切。李晓等[38]研究发现，ERCC2、ERCC4基因与骨肉瘤患者化疗的组织学反应有关。同样，另一项研究显示，ERCC2的基因多态性与骨肉瘤患者治疗过程中对顺铂的敏感性有关，并且还与患者的总生存情况有关[39]。Biason等[40]研究发现，ERCC2的基因多态性与骨肉瘤患者的无事件生存率呈正相关，等位基因rs1799793和ERCC2可以作为预测骨肉瘤患者顺铂敏感性的标志物。随后相关研究证实，在中国人群中，ERCC2的基因多态性与骨肉瘤患者对顺铂的敏感性呈正相关[41]。此外，一项关于858例骨肉瘤患者的荟萃分析结果显示，骨肉瘤患者中ERCC2Lys751Gln多态性与患者的总生存率有关，ERCC5his46his的突变与骨肉瘤患者的无事件生存率有关[42]。

5 骨肉瘤干细胞

尽管肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）假说最早在20世纪70年代已经提出了，但直到近几年，干细胞生物学的研究才为这一假说提供了越来越多的实验证据。目前认为，肿瘤内的一个小类具有自我更新与分化能力的细胞亚群细胞被称为CSC，CSC与肿瘤的发生、转移、治疗抵抗和复发有关。已有研究发现，CSC可能参与肿瘤MDR机制[43]。

虽然CSC与骨肉瘤细胞耐药性的具体作用机制仍未被清楚地阐明，但CSC介导骨肉瘤的MDR已被证实。CSC药物外排系统增强时，某些ABC多药物转运蛋白（如P-gp）在CSC中的表达水平明显增加。通过免疫荧光显微镜观察发现，骨肉瘤干细胞中ABCG2的表达水平明显高于肿瘤细胞，其外排药物的能力不受ABCB1抑制剂（维拉帕米）的影响[44]。化疗药物通常可以引起DNA损伤或干扰细胞代谢，当DNA损伤严重或DNA修复不足时，可导致细胞凋亡。因此，CSC DNA修复效率的提高可以导致化疗耐药。在对骨肉瘤干细胞的研究中发现，骨肉瘤干细胞中DNA修复基因（MLH1和MSH2）的表达明显上调[45]。干细胞具备的解毒机制在骨肉瘤耐药中也起到了一定作用。相关研究表明，在骨肉瘤干细胞中乙醛脱氢酶-1的解毒作用明显强于骨肉瘤细胞[46]。骨肉瘤干细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2、IAP-1、IAP-2及survivin的表达水平较骨肉瘤细胞明显增加，抗凋亡能力较骨肉瘤细胞明显增强[47]。骨肉瘤干细胞也可以通过p53和RB途径逃避衰老和凋亡，从而抵抗化疗的作用。刘盖为等[48]研究发现，对顺铂耐药的骨肉瘤细胞干细胞特性增强，而Notch信号通路激活可能是导致其干细胞特性增强和细胞耐药的主要原因。

6 自噬相关化疗抵抗

Autophagy是希腊术语中“自我吞噬”之意，又称Ⅱ型程序性细胞凋亡，以电镜下出现大量双层膜的自噬体为特征，是指蛋白质转换过程中起管家作用的物质允许细胞消除不需要的蛋白质或已损坏的细胞器。在饥饿、低氧及细胞毒性作用等压力性环境下，细胞自噬作为能量来源，为机体提供氨基酸来维持细胞生存[49]，其对细胞存活、代谢及生长等不同生物学功能发挥了关键作用。自噬是一把双刃剑，一方面，自噬可以帮助清除受损的细胞器和蛋白质从而促进肿瘤生长；另一方面，持续或过多的自噬促进了肿瘤细胞的程序性死亡。近年来，肿瘤细胞自噬和化疗耐药之间的关系成为研究的热点。抑制肿瘤细胞自噬可以增强化疗效果并促进肿瘤消退。

研究发现，在急性髓系白血病、肺癌、胃癌、食管癌、骨肉瘤、卵巢癌等多种人类肿瘤细胞中，自噬相关基因与MDR过程相关[50-51]。自噬的调控，在包括人类在内的哺乳动物细胞内主要是依赖雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，MTOR）途径。Gazitt等[52]研究发现，在人类骨肉瘤的多种细胞系中，雷帕霉素及其他MTOR抑制剂能够通过抑制细胞中MTOR信号通路的活性，调控细胞自噬，从而导致增殖期细胞数目减少，达到抑制骨肉瘤细胞生长目的。Xie等[53]研究发现，雷帕霉素能够通过抑制人骨肉瘤MG63细胞的增殖，降低MG63细胞MTOR通路组件的磷酸化水平。同时，应用自噬抑制剂可以增强雷帕霉素诱导的MG63细胞凋亡作用。还有研究发现，热休克蛋白90抑制剂具有抗肿瘤作用，其作用机制为抑制MTOR激活自噬，与自噬抑制剂联合应用同样能显著提高骨肉瘤细胞的凋亡水平[54]。一项关于人骨肉瘤MG63细胞的对照研究发现，大剂量顺铂处理组MG63细胞的Beclin-1mRNA表达水平明显高于低剂量顺铂处理组和非顺铂处理组，同时给予顺铂联合自噬抑制剂可以明显增加MG63细胞的增殖抑制率。该研究结果提示，大剂量顺铂可能通过过度激活骨肉瘤细胞的自噬导致耐药[55]。此外，多种化疗药物可以诱导人骨肉瘤细胞中Beclin-1的表达上调，而敲除Beclin-1基因或使用自噬抑制剂时，骨肉瘤细胞对化疗更为敏感。

miRNA可对细胞自噬进程起调控作用，其主要机制可能与miRNA调控药物转运相关基因表达有关。已有研究发现，对多柔比星耐药的骨肉瘤细胞中miRNA-30a的表达明显下调，自噬活性明显增加[56]。

7 长链非编码RNA功能失调相关耐药

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是指无特定开放阅读框，不编码蛋白质的一类RNA分子，其核苷酸数目通常大于200。lncRNA可以通过多种方式改变细胞的耐药性，如增加药物代谢、增强药物外排、细胞周期的改变、细胞凋亡异常、上皮-间质转化等。Li等[57]研究发现，与正常组织相比，骨肉瘤组织中lncRNA HOTTIP（HOXA transcript at the distal tip）明显呈高表达。用不同剂量的顺铂处理人骨肉瘤细胞后，细胞中HOTTIP表达水平增高，并通过激活Wnt/β-连环蛋白（β-catenin）途径促进细胞进入S期，从而促进骨肉瘤细胞对顺铂耐药。

Wang等[58]研究发现，大剂量顺铂处理骨肉瘤细胞后可使LINC00161表达水平明显增高，促进骨肉瘤细胞凋亡；而在对顺铂耐药的骨肉瘤MG63细胞中，LINC00161的表达水平明显降低，此时若上调LINC00161的表达则可逆转骨肉瘤MG63细胞对顺铂的耐药性。Zhu等[59]研究发现，人骨肉瘤MG63/DXR细胞系中多种LncRNA表达异常，其中ODRUL、FOXC2-AS1表达水平明显升高，NR-036444表达水平明显降低。推测人骨肉瘤MG63/DXR细胞对多柔比星的敏感性可能与ODRUL、FOXC2-AS1调节MDR基因（包括ABCB1、HIF1A、FOXC2等）的表达有关。随后，Zhang等[60]的细胞学研究证实，在体外骨肉瘤细胞中ODRUL通过促进ABCB1基因的表达，使P-gp表达水平增高，导致骨肉瘤细胞对多柔比星的耐药性增加。Feldstein等[61]研究发现，抑制LncRNA XLOC006942（ERIC）的表达可以促进依托泊苷诱导的人骨肉瘤细胞凋亡，表明ERIC可能与骨肉瘤细胞对依托泊苷的敏感性有关。

8 小结与展望

通过对上述与骨肉瘤化疗MDR发生的相关机制进行综述，可以发现多种分子信号转导通路在骨肉瘤化疗MDR发生发展中起重要作用。学者应提高对信号转导通路在骨肉瘤MDR发生中作用的认识，寻找更多MDR发生的相关信号通路，为后期开发出更多针对该相关信号通路的分子靶向药物打下基础。同时，骨肉瘤化疗出现MDR为多因素综合作用的结果，各因素之间可存在一定的交互作用，如非编码RNA既可以调节耐药基因的表达，也可以对细胞自噬产生影响。因此，针对传统化疗方案效果不佳的骨肉瘤患者，适时调整或整合针对上述耐药机制的综合治疗方案有助于提高化疗敏感性。目前有关骨肉瘤化疗出现MDR的研究取得了长足进步，但在以下两个方面仍存在不足：①目前临床研究热点多集中在研究与骨肉瘤化疗敏感性有关的原发因素上，而针对MDR耐药机制的治疗措施研究鲜有报道；②由于骨肉瘤的发病率相对较低，目前多数研究集中在骨肉瘤细胞系的基础之上，尚缺乏根据骨肉瘤患者血清或病理组织标本相关的实验研究。针对上述不足，认为随着互联网医疗模式的发展，建立相应的骨肉瘤多中心信息共享机制势在必行，同时应多学科合作，完善与骨肉瘤化疗MDR相关机制的研究，使更多的新型化疗药物应用于临床，进一步提 高骨肉瘤患者预后。