微乳液相色谱法测定家兔血浆中磺胺间二甲氧嘧啶的浓度

徐彤彤，郭晓靖，陈晓颖，李宁

(广东药科大学药学院，广东 广州 510006)

磺胺间二甲氧嘧啶(sulfadimethoxypyrimidine，SDM)是一种磺胺类药物，具有较强的抗菌及原虫感染的作用，常被用作饲料添加剂及畜禽疾病的预防和治疗。同时，SDM也具有一定毒性，可引起过敏、造血系统障碍、急性溶血性贫血等。因此，磺胺间二甲氧嘧啶在食品性动物组织中的残留问题备受关注[1]。生物样品中被测成分常常需要提取分离后才能进行色谱分析，前处理方法有液-液提取法、固相萃取柱法、柱切换技术、衍生化法等[2-3]。目前，磺胺类药物残留量的检测方法有液相色谱分析法、液质联用分析法、免疫分析法、放射免疫分析法、酶联免疫吸附法等[4]。

微乳液相色谱法(microemulsion liquid chromato-graphy，MELC)是一种以微乳作为流动相的检测方法，溶质的保留由它在固定相、微乳分散相和水相之间的分配平衡决定[5]，其可控参数较多，容易改善溶质的保留行为，提高分离度。与常规高效液相色谱法相比，MELC具有分离效果好和分离速度快的优势，可用于分离复杂样品，如血清、尿液、血浆等[6-7]；又因为微乳可溶解蛋白质，所以MELC能够实现生物样品直接进样进行分析的目标[5,8]。文献[9-11]分别报道了采用MELC直接测定血浆中的紫杉醇、大黄素、苯乙醇苷类生物样品的可行性。本文建立了用微乳流动相对磺胺间二甲氧嘧啶血浆样品进行前处理后直接进样分析的简便快速的MELC方法。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪(配有LC-15C输液泵，SIL-10AF自动进样器，CTO-10ASvp柱温箱，SPD-M20A紫外检测器，LC solution工作站)；Agilent 5 TC-C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；JJ2000B电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；YP6001N电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；BNX-300超声波清洗机(苏州比能信电气有限公司)；S210 SevenCompact pH计(梅特勒-托利多国际股份有限公司)；TD4台式离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)；TGL-16G高速台式离心机(上海垒固仪器有限公司)；FB-10T溶剂过滤瓶(奥特赛恩斯仪器有限公司，天津)；SHB-ⅢG型台式循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；DZF-6020台式真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.2 试药

磺胺间二甲氧嘧啶对照品(SDM，中国兽医药品监察所，批号：C0061007，100 mg)；磺胺喹噁啉对照品(SQ，中国兽医药品监察所，批号：H0251407，100 mg)；十二烷基硫酸钠(SDS，分析纯，美国Sigma公司)；十二烷基聚乙醇醚(Brij35，纯度99.9%，美国Amresco公司)；正丁醇、正辛烷、正辛醇(分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司)；环己烷、正庚烷(分析纯，东莞市乔科化学有限公司)；甲醇(分析纯，J.T.Baker公司)；磷酸(分析纯，广州化学试剂厂)；蒸馏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)；其他试剂均为分析纯。

1.3 动物

普通级新西兰兔1只，雌雄不拘，体质量2.0～2.5 kg，广东药科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(粤)2012-0125。

2 方法与结果

2.1 微乳流动相的制备

将表面活性剂(十二烷基硫酸钠，SDS)、助表面活性剂(正丁醇)、油相(环己烷)、水相按质量分数分别为2.0%、6.0%、0.8%、91.2%进行混合，超声15 min至完全溶解，即得透明稳定的微乳溶液。用磷酸调节微乳流动相pH至5.0，经0.45 μm滤膜过滤，静置过夜，待用。

2.2 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18(2)色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，流动相：2.0%SDS-6.0%正丁醇-0.8%环己烷-91.2%水(pH5.0)，柱温：30 ℃，检测波长：270 nm，流速：0.7 mL/min，进样量：20 μL。

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液的制备 精密称取磺胺间二甲氧嘧啶对照品10 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精确吸取1 mL，置25 mL量瓶中，加微乳流动相稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

2.3.2 内标溶液的制备 精密称取磺胺喹噁啉对照品10 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。精确吸取1 mL置5 mL量瓶中，加微乳流动相稀释至刻度，摇匀，吸取该溶液4 mL置5 mL量瓶中，加微乳流动相稀释至刻度，即得磺胺喹噁啉内标溶液。

2.3.3 质控样品工作液的制备 精密量取磺胺间二甲氧嘧啶对照品储备液适量，用微乳流动相配制成0.4、16、160 μg/mL的系列质量浓度。

2.4 血浆样品的采集

家兔禁食24 h，以颈动脉采血15 mL，置于含有肝素钠的离心管中，混匀，以3 000 r/min离心10 min，分离血浆，混匀，分装，置-20 ℃冰箱保存。

2.5 样品预处理

2.5.1 微乳作为蛋白沉淀剂 血浆于室温中自然解冻，摇匀，取血浆400 μL，加入磺胺喹噁啉内标溶液100 μL、微乳流动相700 μL于10 mL EP管中，涡旋振荡1 min后，静置，上清液过0.45 μm滤膜，取20 μL进行液相色谱分析。

2.5.2 乙腈作为蛋白沉淀剂 血浆于室温中自然解冻，摇匀，取血浆400 μL，加入磺胺喹噁啉内标溶液100 μL、乙腈700 μL于10 mL EP管中，涡旋振荡1 min后，16 000 r/min离心10 min，上清液过0.45 μm滤膜，取20 μL进行液相色谱分析。

2.5.3 甲醇作为蛋白沉淀剂 除了将“乙腈700 μL”改成“甲醇700 μL”外，其余按“2.5.2”项方法操作。

2.6 方法学考察

2.6.1 专属性试验 取空白血浆400 μL，加微乳流动相800 μL，按“2.5.1”项方法操作，进样分析。取血浆400 μL，加入磺胺喹噁啉内标溶液100 μL、磺胺间二甲氧嘧啶对照品溶液100 μL、微乳流动相600 μL，按“2.5.1”项方法操作，进样分析。本研究考察了乙腈、甲醇和微乳3种蛋白沉淀剂对血浆样品前处理的影响，SDM的保留时间分别为 8.5、8.5、8.4 min，SQ的保留时间分别为9.9、9.9、9.7 min，见图1。

86420-1mAU10.07.55.02.50.017.515.012.510.07.55.02.50.0-2.5-5.012.510.07.55.02.50.0-2.5mAU17.515.012.510.07.55.02.50.0-2.5SDMSQSDMSQSQSDM0.02.55.07.510.012.515.0t/min0.02.55.07.510.012.515.0t/min0.02.55.07.510.012.515.0t/minABCDEF17.515.012.510.07.55.02.50.0-2.5-5.0

A.空白血浆微乳处理； B.空白血浆乙腈处理； C.空白血浆甲醇处理； D.空白血浆中加对照品微乳处理； E.空白血浆中加对照品乙腈处理； F.空白血浆中加对照品甲醇处理。

图1不同样品前处理方法微乳液相色谱图

Figure1MELC chromatograms of different sample pretreatment methods

2.6.2 线性关系 精密量取磺胺间二甲氧嘧啶对照品储备液适量，用微乳流动相配制成0.1、0.4、1.0、4.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的系列质量浓度，精密量取上述各溶液400 μL，置于10 mL EP管中，加入血浆400 μL、内标100 μL、微乳流动相700 μL，摇匀，按“2.5.1”项下方法处理后进样。以SDM与内标SQ峰面积之比(y)对SDM质量浓度(x)进行线性回归，得线性回归方程y=0.4365x+0.1435，r=0.999 8。结果表明SDM在0.1～50 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，定量限(以信噪比为10对应的质量浓度计)为0.1 μg/mL。

2.6.3 精密度试验 分别取空白血浆400 μL，加入不同浓度的SDM质控样品工作液，配制成低、中、高(0.1、4.0、40.0 μg/mL)3种质量浓度的血浆样品，按“2.5.1”项方法操作，进样分析。测定日内和连续3 d的日间变异，并通过标准工作曲线计算其浓度，并与加入浓度对比计算其准确度。结果(见表1)表明，所有样品的日内精密度RSD和日间精密度RSD均小于10%，同时低、中、高3种浓度准确度在92%～102%范围内，符合生物样品分析要求。

2.6.4 稳定性试验 分别取空白血浆400 μL，加入SDM质控工作液，配制成低、中、高(0.1、4.0、40.0 μg/mL)3种质量浓度的血浆样品，分别考察处理过的生物样品在室温放置0、1、2、3、4 h的稳定性。结果表明低、中、高3种质量浓度样品的SQ峰面积与SDM峰面积之比的RSD分别为0.24%、0.02%、0.02%，表明样品在室温下4 h内稳定性良好。

2.6.5 回收率试验 分别取空白血浆400 μL，加入不同浓度的质控样品工作液，分别配制低、中、高(0.1、4.0、40.0 μg/mL)3种质量浓度的SDM血浆样品，每个质量浓度平行做5份，按“2.5.1”项下方法处理后进样分析，结果(见表1)表明，低、中、高3种质量浓度样品的回收率分别为(94.6±8.2)%、(92.8±2.7)%、(100.2±1.0)%，符合生物样品分析要求。

表1 血浆样品中SDM的方法回收率试验与精密度试验结果Table 1 Method recovery，precision test of SDM in plasma samples

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

本文的初始流动相为2.0%SDS-6.0%正丁醇-0.8%正辛醇-91.2%水，以磷酸调节pH为3.7，在此基础上进行单因素考察和条件优化。

3.1.1 表面活性剂的影响 选择5种微乳流动相体系MP1～MP5(见表2)，考察了SDS、Brij35、SDS+Brij35作为表面活性剂对SDM和SQ的分离效果，结果(见表3)表明，以SDS作为表面活性剂可以使SDM和SQ在较短时间内达到基线分离，而加入Brij35，样品的分析时间较长，且拖尾较严重。故选择SDS作为表面活性剂。同时，MP1～MP3考察了1.0%～3.0%SDS对SDM和SQ分离的影响，结果(见表3)发现，随着SDS浓度的增加，SDM和SQ的洗脱速度加快，保留时间缩短:2.0%SDS时,SDM保留时间适中，峰型较好;3.0%SDS时,拖尾严重;1.0%SDS时,分离时间较长。

表2 5种微乳流动相体系的组成

Table2The composition of the mobile phasew/%

表3 不同表面活性剂的药物保留时间、分离度和拖尾因子

Table3Retention time,resolution and tailing factor for different surfactants

表面活性剂药物保留时间/min分离度拖尾因子6.0%Brij35+0.2%SDSSDM19.81 1.64 1.44 SQ21.82 1.42 6.0%Brij35SDM15.74 1.71 1.62 SQ17.48 2.18 1.0%SDSSDM21.15 1.39 1.96 SQ27.75 1.36 2.0%SDSSDM9.22 2.49 1.40 SQ10.78 1.28 3.0%SDSSDM8.01 2.05 1.52 SQ9.15 1.32

3.1.2 助表面活性剂的影响 助表面活性剂一般采用正丁醇，在可形成微乳的范围内，随助表面活性剂浓度的增加，溶质的洗脱速度加快[10]，但随流动相中有机相比例的增加，柱压明显升高。从保留时间、柱压等方面考虑，本文选用6.0%正丁醇为助表面活性剂。

3.1.3 油相的影响 考察了正辛醇、环己烷、正辛烷、正庚烷为油相对溶质洗脱的影响(见表4)。结果表明，洗脱速度以正庚烷>环己烷>正辛烷>正辛醇，以环己烷为油相的微乳流动相，对药物的分离选择性较好，保留时间适宜，峰型较好。文献[11]报道，油相在水包油型微乳中的质量分数一般为0～1.2%，高于1%时，微乳系统不稳定，色谱重现性较差，最佳约为0.8%。故本研究选择油相为0.8%环己烷。

3.1.4 水相pH值的影响 SDM和SQ是两性化合物，以弱碱性为主。本研究考察了不同pH(3.0、3.7、4.3、5.0)对SDM和SQ色谱峰型的影响。结果(见表5)发现，流动相pH约为5.0时，色谱峰型较好，保留时间适宜，血浆中杂质干扰较少。在上述优化条件下，SDM和SQ的分离良好，血浆中的内源性物质无干扰。

表4 不同油相的药物保留时间、分离度和拖尾因子

Table4Retention time,resolution and tailing factor for different oils

油相药物保留时间/min分离度拖尾因子正辛醇SDM11.60 3.04 1.46 SQ13.91 1.49 环己烷SDM9.68 3.54 1.13 SQ11.34 1.15 正辛烷SDM10.21 4.11 1.58 SQ12.26 1.14 正庚烷SDM7.61 2.88 1.08 SQ8.75 1.12

表5 不同pH值水相的药物保留时间、分离度和拖尾因子

Table5Retention time,resolution and tailing factor for different pH of waters

pH值药物保留时间/min分离度拖尾因子3.0 SDM12.813.531.22SQ15.541.123.7 SDM9.683.541.13SQ11.341.154.3 SDM8.603.951.18SQ10.151.025.0 SDM8.403.481.18SQ9.851.16

3.1.5 波长的选择 将含内标物的对照品溶液在200～400 nm之间进行紫外扫描，结果显示SDM在209、249、268 nm有较大吸收，而SQ在274 nm有较大吸收，故选择270 nm为检测波长。

3.1.6 内标物的选择 本研究所选用的SQ与SDM的油水分配系数(logP)相近(logPSDM=1.63，logPSQ=1.68)，SDM的pKa为5.7，而SQ的pKa为5.1，两者性质相似且在微乳进样时能达到完全分离，不发生化学反应，回收率符合要求，故选择SQ为内标物。

3.2 方法学考察

本研究考察了乙腈、甲醇和微乳3种蛋白沉淀剂对血浆样品前处理的影响，结果表明经乙腈处理过的血浆样品内源性物质干扰较少。同时考察了加入甲醇或乙腈后，离心取上清液真空抽干再用微乳溶剂溶解，结果发现SDM和SQ的提取率降低，且操作繁琐，增加误差。本文结果表明，使用乙腈和微乳对样品进行前处理，效果相近，回收率均达95%以上。考虑到微乳使用的有机溶剂用量少、毒性低、有经济和环保方面的优势，故采用微乳对样品进行前处理。

本研究通过考察微乳流动相各组分对溶质洗脱的影响，建立了优化的MELC法用于测定血浆中的SDM，利用微乳对脂溶性和水溶性物质都有溶解能力的特点，血浆样品只需用适量的微乳流动相稀释即可直接进样分析，减少前处理和有机溶剂的使用，减少操作的繁琐和误差的引入，且毒性低、经济环保。