呼出气分析在胃癌筛查和诊断中的研究进展

李琦,郭雷,李恩有

根据中国2015年的癌症数据统计，胃癌的发病率和病死率在男性中均位居第二，在女性中分别位于第三位和第二位，成为仅次于肺癌的严重威胁中国人健康的重大疾病[1]。临床上目前最常用的诊断胃癌的方法有X线钡餐、磁共振成像(MRI)、纤维胃镜以及血清肿瘤标志物等[2]，还没有相对操作简单且特异性高的筛查方法，因其发病也十分隐匿，在临床工作中许多病人对于侵入性内镜活检存在恐惧而拒绝接受检查，因此胃癌发现时多为中晚期，丧失了最佳治疗时机，因此寻求一种行之有效且能普遍应用的筛查技术来进行胃癌高危人群的定期普查已成为临床的迫切需求。

近年来，呼出气分析提供了一种潜在的无创性疾病诊断工具的可能，且具有易于操作、病人依从性高等优点，可提供一个窥视人体新陈代谢的 “窗口”。1972年，诺贝尔奖获得者Teranishi首次提出呼出气体中含有250余种可挥发的有机化合物[3]。在随后的30年中，由于科技进步以及各种分析仪器的发明，研究者们开始对呼出气中挥发性有机物进行定性、定量分析。

目前，被美国食品药品管理局批准的呼气测试如下，即(1)呼气中乙醇浓度的检测:用于法律实施。(2)呼气中的氢检测:用于分析人体中碳水化合物的代谢情况。(3)监测呼气中一氧化氮(NO)浓度:用于识别哮喘。(4)13C-尿素呼气试验:临床上作为诊断感染幽门螺杆菌的金标准之一，也是根除幽门螺杆菌治疗后复查的首选方法。(5)呼气中支链饱和烃类物质的种类和浓度分析:用于检测心脏移植手术中的排异反应的程度。

临床医生一直在试图建立一个能够联系呼出气与重要肿瘤疾病的诊断关系，关于癌症呼出气挥发性有机化合物(VOCs)产生的病理生理过程，目前有假说认为呼出气VOCs改变是基于肿瘤细胞膜上多不饱和脂肪酸影响细胞氧化，从而导致肿瘤细胞内基因/蛋白突变以及细胞内活性氧的增加，进而产生了新的挥发性有机物或引起正常挥发性有机物含量改变[4-6]。目前已经成功的在乳腺癌、结直肠癌、肺癌、胃癌等[7-9]疾病中发现了特异的呼出气VOCs肿瘤标志物，以色列的科学家最近发现呼出气可以诊断17种癌症[10]，这一研究成果已经引起国际科技领域广泛关注，这其中也包括胃癌，现于2017年7月将胃癌呼出气诊断的国内外研究进展做一综述，以期为呼出气早期筛查和诊断胃癌提供更多的参考依据。

1 在胃癌病人呼出气中检测VOCs

由于VOCs分析技术、采样方式、不同临床环境下样品的差异、混杂因素、生理因素等诸多因素的影响[11]，目前还没有可以用于标准化临床诊断或筛查癌症的呼出气检测。现就不同分析方法分组介绍胃癌呼出气VOCs的研究。

1.1 气相色谱--质谱联用仪分析胃癌呼出气VOCs气相色谱--质谱联用仪即GC-MS，呼出气中的挥发性有机物经过色谱高效分离后进入质谱后可以进行识别和量化。GC-MS可以全面、准确地分析呼出气包括其中未知的VOCs，广泛应用于呼出气研究中，但有昂贵、费时、操作繁琐、便携性差等缺点，这可能在临床应用中产生困难。

Ligor等[12]使用固相微萃取(SPME)GC-MS法对3例胃癌组织细胞的顶空VOCs、3例胃癌病人和7例正常健康人的呼出气VOCs进行分析，检测到丙酮、二硫化碳、异丙醇、乙醇和乙酸乙酯这几种VOCs，认为这些化合物是人体内源性产物。

丁露等[13]使用SPME GC-MS法对37例胃癌病人、32例正常健康人进行呼出气分析，发现丙烯腈(浓度范围14.72 ～594.29 ng/L)和甲基环己烷(浓度范围9.20～970.89 ng/L)可以作为胃癌潜在的呼出气挥发性标志物。

还有研究者使用SPME GC-MS法对30例胃癌病人、20例健康人进行呼出气分析，发现己醛、5-乙基-5甲基-葵烷、壬烷仅在胃癌病人呼出气中可检测。同时，胃癌病人呼出气中乙醇、丙酮、己醇、薄荷醇的相对含量明显高于健康对照组，且呼出气异戊二烯的浓度低于健康对照组，而在Xu等[14]使用纳米传感器分析，呼出气异戊二烯在胃癌病人组中明显升高，两组研究者得出了不同结论，值得进一步研究。

1.2 传感器阵列分析胃癌呼出气VOCs传感器阵列是将纳米材料或各种不同金属、化学物质和传感器相结合形成一个气体探测器来实现呼出气分析，它通过识别特定呼出气VOCs组合来进行疾病诊断[16]。传感器阵列易于操作、方便快捷、临床应用前景大，但其缺点是不能分析未知呼出气挥发性有机物，且不能定量[15-16]。

Xu等[14]研究了基于纳米材料的呼吸试验来鉴别胃癌和胃良性病变，他们使用GC-MS法以及纳米传感器法对130例胃部疾病病人的呼出气样本进行检测并采用判别因子分析(DFA)模式识别建立预测模型。结果显示呼出气可以区分各组亚群：胃癌与胃部良性病变灵敏度89%、特异性90%、准确性90%，早期 (Ⅰ期和Ⅱ期)与晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)胃癌灵敏度89%、特异性94%、准确性91%，且混杂因素不敏感。呼出气化学分析发现了5种挥发性有机物(2-丙烯腈、2-丁氧基乙醇、糠醛、甲基庚烯酮和异戊二烯)在胃癌以及消化性溃疡病人中明显升高，可以作为胃癌呼出气的生物标志物。之后Amal等[17]进行了进一步研究，收集来自484例病人的968个呼出气样本进行检测，使用2种分析方法：GC-MS和与模式识别相结合的交叉反应纳米阵列。研究结果发现使用GC-MS可以在胃癌组和高风险胃癌组(OLGIM Ⅲ～Ⅳ)找到独特的呼出气VOCs组合，在各组间检测到8种呼出气VOCs(2-丙烯腈、糠醛、乙二醇丁醚、十六烷、4-甲基辛烷、1,2,3-三甲基苯、α-甲基苯乙烯、2-丁酮)。基于纳米材料的呼出气检测则可以区分胃癌与胃黏膜肠上皮化生(OLGIM 0～Ⅳ)，其灵敏度73%、特异性98%、准确性92%，区分胃癌与OLGIM 0～Ⅱ的灵敏度为97%、特异性84%、准确性87%，区分胃癌与OLGIM Ⅲ～Ⅳ的灵敏度93%、特异性80%、准确性90%，区分OLGIMⅠ～Ⅱ与OLGIM Ⅲ～Ⅳ的灵敏度83%、特异性60%、准确度61%。

Chen等[18]研制了一种基于表面增强拉曼散射(SERS)传感器来检测胃癌呼出气中的生物标志物。在SERS传感器中，还原性氧化石墨烯(RGO)可以选择性地吸附和富集呼出气中的生物标志物，SPME纤维和金纳米粒子分散在RGO上使SERS传感器有效地检测被吸附的生物标志物。14个与生物标志物相关的拉曼光谱被选为生物标志物模式指纹来区分不同国家的人的呼出气VOCs。他们应用该方法分析了不同的呼出气标本和200例临床呼出气样本：灵敏度83%、特异性92%,也发现该方法的使用不仅可以进行胃癌诊断，更可以对早期胃癌和晚期胃癌进行区分。

学者们[19]使用金属氧化物半导体气体传感器阵列分析了161例志愿者的呼出气，其中包括49例胃癌和30例胃溃疡病人，发现胃癌病人呼出气以及胃组织顶空VOCs中的丙酮、二硫化碳、异丙醇、乙醇、乙酸乙酯可以用来诊断胃癌，并采用反向传播神经网络算法统计出准确性93.00%、灵敏度94.38%和特异性89.93%。

1.3 选择性离子流管质谱分析胃癌呼出气VOCs选择性离子流管质谱即SIFT-MS，它结合了流动管技术、化学电离技术以及质谱来对呼出气中的VOCs进行定性定量分析。SIFT-MS可快速实时在线分析[20]，且无须对样品进行吸附解吸。

Kumar等[21]利用SIFT-MS对三组受试者进行呼出气分析：18例胃-食管癌、18例非癌上消化道疾病、17例健康受试者。他们在呼出气中检测到17种VOCs，使用曼-惠特尼U检验发现4种VOCs(己酸、苯酚、甲基酚和乙基苯酚)在癌症组与其他组差异有统计学意义。使用受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析4种VOCs组合来区分食管-胃癌组和对照组，结果显示ROC曲线下面积(AUC)为0.91，更加说明了这些VOCs可以作为食管-胃癌潜在的非侵入性生物标志物。

该团队进行进一步研究[22]，同样使用SIFT-MS方法对81例食管胃癌病人(食管癌48例，胃腺癌33例)、129例对照病人(Barrett化生16例，良性上消化道疾病62例，正常健康人51例)进行呼出气分析，发现了12种VOCs，并认为脂肪酸、苯酚和醛类化合物可以作为食管和胃腺癌潜在的生物标志物。

2 胃癌呼出气中检测冷凝液(EBC)

受试者平静呼吸，其呼出气体通过特殊的装置冷凝后形成液态，即EBC。据研究报道，在EBC中可以检测到的物质高达数千种[23-24]，且不断有新的物质被检测出来，它们主要源于下呼吸道的内衬液[25]。通过研究发现于EBC中寻找肺癌的特异性肿瘤标志物，或是多种标志物联合应用来诊断肺癌，对其筛查、早期诊断、监测病情及判断预后情况均有着重大的临床实用价值[26-28]。而相比传统检测手段，EBC的采集是一个完全无创的过程，不会对支气管黏膜产生伤害，且EBC直接来源于下呼吸道[29]，没有被稀释的可能，故而其结果可信度高，检测结果的可重复性好，瞬时可实现动态监测，且EBC采集技术适用于任何年龄、任何身体状况的病人，在临床上有很好的应用前景。

王兵等[30]应用 EcoScreen冷凝器采集了66例胃癌病人及60例健康受试者的呼出气冷凝液，并使用免疫酶法对胃癌呼出气EBC中的P53蛋白水平进行检测。结果显示：胃癌病人组的呼出气EBC中P53蛋白水平高于正常对照组(P<0.01)，较之Ⅰ期，Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ期的胃癌病人EBC中P53蛋白浓度较高(P<0.05)，胃鳞癌和胃腺癌病人EBC中的P53蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)，EBC中P53蛋白检测的灵敏度和特异性分别为42.4%和93.4%，由此得出结论：检测胃癌病人EBC中P53蛋白可用于胃癌的辅助诊断及病情监测。他们还发现免疫组化(SP)法检测胃癌组织P53蛋白与免疫酶法检测EBC中 P53蛋白这两种检测途径差异无统计学意义。

3 胃癌呼出气VOCs的地域差异

Amal等[31]使用GC-MS方法对中国和拉脱维亚共260位病人呼出气进行分析，观察到中国和拉脱维亚的胃癌病人呼出气是不同的。在两个国家中,受试者呼出气6-甲基-5-庚烯-2-酮可以区分胃癌组和健康对照组，呼出气中芳香族化合物和醇类可以区分消化性溃疡组和健康对照组，胃癌组与消化性溃疡组没有被区分开。研究中发现挥发性有机物的组成可能受到地理、环境和生活方式的影响，这可能是由于不同种族之间遗传和营养差异引起个体之间细胞氧化速度不同，从而造成VOCs差异，因此建立一个该地区人群适用的呼出气诊断模型是必要的。

4 肠道微生物环境对胃癌VOCs影响

Leja等[32]使用GC-MS和纳米传感器分析了10例同一个胃癌病人连续3 d呼出气、17例胃癌病人幽门螺杆菌治疗前后的呼出气、61例胃癌病人肠道清洗前后的呼出气，发现同一个病人3 d内呼出气VOCs是稳定的，证明了VOCs分析的可复性和重现性，α-蒎烯(P=0.028 0)、乙酸乙酯(P=0.030 0)在抗生素应用后增加，丙酮在结肠镜检查前肠道准备后增加(P=0.000 1)，说明抗生素和肠道准备重建的肠道微生物环境影响了呼出气VOCs的结果。所以需要进行更多研究来验证VOCs分析的准确性。在这些标志物成功转化为临床实践之前仍需要克服许多挑战,样品采集和处理的标准化也是临床研究的关键因素[33]。

综上所述，目前胃癌呼出气的研究主要是在GC-MS、传感器阵列、SIFT-MS、EBC这几个方面，国内外相关研究还相对甚少。因此，更多关于胃癌呼出气诊断方面的研究需要探索，未来的研究领域包括胃癌呼出气VOCs可能的生化通路研究，标准化呼吸试验和特定胃部疾病大型多中心人群呼出气诊断研究。