控释掺混氮肥对稻麦土壤微生物及酶活性的影响

李新悦，王昌全，李 冰*，何 杰，李玉浩，张敬昇，梁靖越，陈 兰，尹 斌

（1．四川农业大学资源学院，四川 成都 611130；2．中国科学院南京土壤研究所，江苏 南京 210008）

氮素是植物生长的生命元素，三大营养元素之一。我国氮肥总使用量自20世纪90年代以来上升很快，达到世界的35%左右［1］。高氮施入提高了粮食产量，但是氮肥的不合理施用，会造成严重的环境污染，影响土壤微生物丰度和群落结构，反而不利于作物的优产、高产［2-3］。控释氮肥作为一种新型高效肥料迅速成为研究热点，它能使其中有效养分缓慢释放，避免氮肥过量输入和保持较长肥效，还具有减少施肥作业次数、节省劳力和费用等优点［4-5］。国内外已有研究表明，控释氮肥不仅可以促进作物增产，同时还能减少氮素损失，减小对环境的污染［6-7］。然而，目前控释氮肥成本较高，且氮素释放较慢，单施控释氮肥易造成作物前期养分供应不足，生长受限，故本试验采用控释氮肥掺混尿素处理，以期达到速效、控释氮肥的优势互补，使其更具生产实践意义。施氮量和养分供应同样影响着土壤的微生态环境变化［8-10］，土壤微生物和酶活性在促进土壤代谢、提高土壤肥力、优化作物种植技术等方面有重要意义［11-12］。本文通过盆栽试验，研究不同控释氮肥掺混比例对小麦、水稻不同生育期土壤中微生物数量以及酶活性变化的影响，从土壤生物学变化角度，探讨控释氮肥可能带来的生物学效应及土壤微生态环境的变化规律，为改善农田土壤生态环境，推广麦稻轮作下控释掺混尿素一次性施肥技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验区概况

试验于2015年11月至2016年9月在四川农业大学资源学院盆栽研究室进行。供试土壤类型为水稻土，采自四川农业大学崇州市桤泉镇试验基地0～30 cm耕层。土壤基础养分含量为有机质26.96 g·kg-1，全氮 1.33 g·kg-1，碱解氮 58.25 mg·kg-1，有效磷 12.45 mg·kg-1，速效钾 95.04 mg·kg-1，pH值6.45。

1.2 供试材料与肥料

供试控释氮肥含氮量41.4%，氮素释放时间约为90 d；供试尿素含氮量46.4%；采用分析纯KH2PO4和KCl作为磷源、钾源。供试小麦品种为内麦836；水稻品种为F优498。

1.3 试验设计

盆栽试验采用内径35 cm、高33 cm塑料盆，每盆装过1 mm筛的风干土15 kg。设计7个处理：CK（不施氮肥）、T1（100%尿素）、T2（控释氮肥10%+尿素90%）、T3（控释氮肥20%+尿素80%）、T4（控释氮肥40%+尿素60%）、T5（控释氮肥80%+尿素20%）、T6（控释氮肥100%）。除CK不施氮外，各处理施氮量一致。小麦季按N 0.15 g·kg-1、P2O50.09 g·kg-1、K2O 0.09 g·kg-1与土壤混合均匀；水稻季对相同处理土壤进行重新装盆，施肥量按 N 0.15 g·kg-1、P2O50.075 g·kg-1、K2O 0.06 g·kg-1与土壤混合均匀，试验处理相同。小麦于2015年11月5日播种，每盆25粒小麦，待出苗后定苗20株，试验过程中，每周浇水1～2次，每次1 L，除草；水稻于2016年5月25日移栽每盆长势均匀良好的水稻4株，拔节期前进行淹水处理，拔节期后对每个盆栽每周浇水2～3次，每次1 L，除草，每个处理重复12次，共84盆，随机摆放。

1.4 样品采集与处理

在小麦分蘖期（播种后58 d）、拔节期（播种后 108 d）、孕穗期（播种后 134 d）、成熟期（播种后182 d）和水稻分蘖期（播种后33 d）、拔节期（播种后62 d）、孕穗期（播种后81 d）、成熟期（播种后126 d）采集土样，对每个处理3个盆栽的小麦、水稻根系带土样挖出，抖掉根系外围土。取根表附近土样，装入无菌袋中，放入4 ℃冰箱中冷藏保鲜，用以测定土壤微生物数量及酶活性。

土壤细菌、放线菌、真菌数量采用涂抹平板计数法测定，分别用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I号培养基以及马丁氏培养基进行分离培养，然后测定每克干土中的微生物菌落数［13］。土壤氨化细菌、硝化细菌和反硝化细菌数量采用稀释计数法（MPN）［14］。土壤脲酶活性采用苯酚钠比色法［15］，土壤蛋白酶活性采用茚三酮比色法［16］。

1.5 数据分析

试验数据用 Excel 2016 和 SPSS 22.0 软件进行分析处理，采用单因素方差分析（P＜0.05），LSD方法进行统计处理。

2 结果与分析

2.1 不同处理对土壤微生物数量的影响

2.1.1 土壤细菌

由表1可知，与CK相比，各施氮处理可有效提高小麦、水稻全生育期细菌数量。在小麦分蘖期，土壤细菌数量随控释氮肥掺混比例的增加而逐渐降低，但处理间无显著差异；拔节至成熟期，小麦季土壤细菌数量均随控释氮肥掺混比例的增加而先升高后降低，且拔节期以T3处理最高，孕穗期和成熟期以T4处理最多，孕穗期T4处理较T1和T6处理分别提高了30.22%、15.97%，成熟期，掺混40%及以上控释氮肥处理比单施尿素T1处理显著提高39.12%～44.12%。

表1 不同处理对小麦季和水稻季土壤细菌数量的影响 （106 cfu·g-1）

水稻季分蘖期，土壤细菌数量随控释氮肥掺混比例的增加而递减，T1处理显著高于控释掺混氮肥处理；拔节至成熟期，土壤细菌数量随控释氮肥掺混比例的增加而先上升后下降，均在T4处理达到峰值，较单施尿素T1处理提高了54.36%～66.96%，较单施控释氮肥T6处理提高19.47%～69.92%；拔节期T3和T4处理处于较优水平，而孕穗期则以T4和T5处理最多，成熟期掺混40%及以上控释氮肥处理均显著高于单施尿素T1处理。

2.1.2 土壤放线菌

由表2可以看出，各施氮处理可以显著提高土壤放线菌数量，且小麦、水稻全生育期内，放线菌数量总体呈上升趋势。在小麦分蘖期，单施尿素T1处理最多，且控释氮肥掺混比例越高，土壤放线菌数量越低；拔节至成熟期，峰值随控释氮肥掺混比例增加逐渐后移，依次为T4（拔节期）、T5（孕穗期）、T6处理（成熟期）；孕穗至成熟期，掺混40%～100%控释氮肥处理土壤放线菌数量明显高于其余处理，且彼此间无显著差异。

水稻分蘖期，单施尿素T1处理较掺混40%及以上控释氮肥处理显著提高了土壤放线菌数量；拔节期，土壤放线菌数量随控氮比增加而先升高后下降，以T3处理最高，T4处理次之，较单施尿素T1处理分别显著提高23.15%（T3）、13.98%（T4）；孕穗至成熟期，掺混20%～100%控释氮肥处理较其余处理明显增加了放线菌数量，其中T3和T4处理处于较优水平。

表2 不同处理对小麦季和水稻季土壤放线菌数量的影响 （105 cfu·g-1）

2.1.3 土壤真菌

由表3可知，施氮处理比CK处理显著提高小麦、水稻土壤真菌数量。小麦分蘖至拔节期，土壤真菌数量分别以T1和T3处理较多，但各施氮处理间无显著差异；孕穗至成熟期，土壤真菌数量基本持平，随控释氮肥掺混比例增加呈现先增加后减少趋势，以T3、T4处理最优，显著高于单施控释氮肥T6处理。

水稻分蘖期，单施尿素T1处理土壤真菌数量最丰富，与掺混40%及以上控释氮肥处理差异显著，且控释掺混氮肥比例越高真菌数量越低；拔节期，掺混40%及以上控释氮肥处理显著高于其余处理；孕穗至成熟期，掺混40%及以上控释氮肥处理土壤真菌数量均处于较优水平，其中以掺混80%控释氮肥处理数量最多，较单施尿素T1处理显著提高了56.92%～89.09%。处理相对最高，较其余施氮处理提高39.67%～96.14%。

表3 不同处理对小麦季和水稻季土壤真菌数量的影响 （104 cfu·g-1）

水稻季土壤氨化细菌数量整体呈先上升后下降趋势，在拔节期出现拐点。分蘖期，各施氮处理间土壤氨化细菌数量差异较小；随生育期的推进，掺混40%及以上控释氮肥处理氨化细菌数量明显较高，与单施尿素T1处理相比在孕穗期和成熟期分别提高了25.38%～40.33%和40.66%～58.58%。

2.2 不同处理对氮转化细菌的影响

2.2.1 土壤氨化细菌

由图1可以看出，施氮处理较CK处理可有效提高小麦、水稻全生育期土壤氨化细菌数量。小麦分蘖期，单施尿素T1处理土壤氨化细菌数量明显高于其余处理，但随生育期的进程持续下降；拔节至孕穗期，掺混40%及以上控释氮肥处理氨化细菌数量小幅上升，明显高于其余施氮处理；成熟期，土壤氨化细菌数量呈下降趋势，T4

图1 不同处理对小麦季和水稻季土壤氨化细菌数量的影响

2.2.2 土壤硝化细菌

由图2可以看出，小麦季土壤硝化细菌数量整体呈先升高后稳定趋势，水稻季则在孕穗期有较为明显的峰值，且施氮均能明显提高两季土壤硝化细菌数量。小麦分蘖期各施氮处理间差异较小；拔节期以T4和T6处理最多，较单施尿素T1处理有明显的提高；孕穗期，T1处理出现了明显的下降趋势，掺混40%及以上控释氮肥处理较单施尿素T1处理提高32.23%～53.17%；成熟期，T4处理土壤硝化细菌数量达到最多，较T1处理提高23.84%。

单施尿素T1处理和掺混10%控释氮肥T2处理水稻季硝化细菌数量在分蘖期相对最多，但在拔节期明显下降，在生育中后期也相对较低；掺混40%及以上控释氮肥处理在生育中后期硝化细菌数量明显较高，且彼此间差异较小；土壤硝化细菌数量在成熟期略微下降，掺混40%～100%控释氮肥处理仍处于较高水平，较单施尿素T1处理提高了26.61%～48.62%。

图2 不同处理对小麦季和水稻季土壤硝化细菌数量的影响

2.2.3 土壤反硝化细菌

由图3可知，与CK相比，施氮处理可有效提高小麦、水稻全生育期土壤反硝化细菌数量。T1、T2处理反硝化细菌数量在小麦分蘖期最高，但随生育期的推进有下降趋势，且T1比T2处理下降幅度大；掺混20%及以上控释氮肥处理反硝化细菌数量呈先上升后下降规律，除T5处理外均在拔节期出现拐点；孕穗至成熟期，掺混80%～100%控释氮肥处理降幅较小或基本持平，反硝化细菌数量仍处于较高水平。

由图3可以看出，水稻季，单施尿素T1处理反硝化细菌数量在分蘖期最多，并随生育期的推进先下降后上升再下降；掺混40%及以上控释氮肥处理则呈先上升后下降规律，在孕穗期出现峰值，以T6处理最高，较T1提高了56.94%。孕穗至成熟期，掺混80%及以上控释氮肥处理反硝化细菌数量较高，且二者差异较小。

图3 不同处理对小麦季和水稻季土壤反硝化细菌数量的影响

2.3 不同处理对土壤酶活性的影响

2.3.1 土壤脲酶活性

从图4可以看出，与CK相比，各施氮处理有利于提高小麦、水稻各生育期土壤脲酶活性。小麦全生育期，脲酶活性呈先上升后下降规律，在拔节期出现拐点。分蘖期土壤脲酶活性随控释氮肥掺混比例增加而呈下降趋势，单施尿素T1处理相对最高，但在生育中后期均低于控释掺混氮肥处理；掺混40%及以上控释氮肥处理在拔节至成熟期较其余处理有明显的提高，均以T4处理脲酶活性最高，较单施尿素T1处理提高了28.70%～69.00%。

从图4可知，水稻分蘖期，单施尿素T1处理脲酶活性最高，控释氮肥掺混比例越高脲酶活性越低；拔节至成熟期，除单施尿素T1处理不断下降外，其余处理呈先上升后下降规律，在孕穗期出现峰值，以T4处理脲酶活性最高；成熟期，掺混40%～100%控释氮肥处理为较优水平，各处理间差异不大，其中T4处理脲酶活性相对较大，较单施尿素T1处理提高23.27%。

图4 不同处理对小麦季和水稻季土壤脲酶活性的影响

2.3.2 土壤蛋白酶活性

从图5可以看出，施氮处理较CK处理明显改善小麦、水稻土壤蛋白酶活性。小麦全生育期，土壤蛋白酶活性均在孕穗期达到最高后下降，控释掺混氮肥处理与T1处理相比，前期增长幅度更大，后期下降更平缓；单施尿素T1处理小麦季土壤蛋白酶活性除在分蘖期外，均明显低于控释掺混氮肥处理；拔节至成熟期，掺混40%～100%控释氮肥处理差异较小，均明显改善蛋白酶活性，孕穗期较T1处理提高了27.89%～30.74%。

水稻全生育期内土壤蛋白酶活性呈现先上升后下降规律，在孕穗期出现拐点。分蘖至拔节期，掺混40%及以上控释氮肥处理蛋白酶活性增长明显，单施尿素T1处理上升幅度相对较小；拔节至孕穗期掺混40%～100%控释氮肥处理与T1处理相比，分别提高了8.37%～17.05%、7.39%～13.84%；成熟期蛋白酶活性以T4处理最高，但掺混40%及以上控释氮肥处理间差异不明显。

图5 不同处理对小麦季和水稻季土壤蛋白酶活性的影响

2.4 土壤微生物数量与酶活性相关性分析

由表4可以看出，土壤微生物数量与土壤酶活性基本达到显著或极显著水平。土壤细菌数量与小麦季脲酶、蛋白酶及水稻季脲酶活性相关程度较高，达到极显著水平，与水稻蛋白酶活性则无显著相关性。土壤放线菌数量与小麦蛋白酶活性相关性达到极显著水平；与小麦季土壤脲酶和水稻季土壤蛋白酶活性相关性显著，但与水稻季土壤脲酶活性则无显著相关性。土壤真菌数量与小麦季土壤蛋白酶、水稻脲酶活性呈极显著相关关系，与小麦脲酶、水稻蛋白酶活性则无显著相关性。土壤氮转化功能菌中，土壤氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌数量与脲酶、蛋白酶活性相关性均较强，除水稻反硝化细菌与蛋白酶活性显著相关外，其余因子间均呈极显著相关关系。从不同作物来看，小麦土壤微生物与酶活性相关性较强，尤其与蛋白酶的相关性均达到极显著性水平；水稻土壤微生物则与脲酶活性相关性较强，与蛋白酶相关性相对较弱。

表4 土壤微生物数量与酶活性的相关系数

3 讨论

土壤有机质形成与养分转化均有微生物参与，土壤微生物数量与土壤质量和肥力高低密切相关［17-18］。同时，微生物活动需要土壤提供养分，科学施氮能有效供给氮素营养［19］。本试验中，小麦、水稻全生育期土壤微生物数量总体呈现先上升后下降趋势，这可能是因为生育中期根系分泌物增多及温度升高利于微生物活动［20-21］。与不施氮CK相比，施氮处理均可有效提高小麦、水稻土壤微生物数量，表明施氮处理可促进土壤微生物生长繁殖［22］。小麦、水稻分蘖期，土壤微生物数量以单施尿素T1相对较高，且随控释氮肥掺混比例增加而减少，这可能是由于尿素的快速供氮，在作物生育前期土壤养分充足，刺激微生物生长繁殖［23］；而控释氮肥则在该时期有效抑制了氮素的释放［24］，且控释氮肥掺混比例越高，氮素释放速率越慢。随着生育期的推进，单施尿素T1处理续氮能力降低［25］，而掺混20%～80%控释氮肥处理逐渐表现出优势，其中以掺混40%控释氮肥处理最优，可能是由于该处理更能综合速效、控释氮肥的优点，达到“前保后释”的效果，使作物生育期内的氮素供应持续且充足［26］，从而为微生物营造了适宜的生长环境［27-28］。氮转化细菌直接参与氮素养分循环，其活跃度随供氮能力强弱而变化［29］，而控释氮肥有效延长了氮素释放周期，本试验条件下掺混40%～100%控释氮肥处理氨化、硝化细菌数量除小麦、水稻分蘖期外，均高于其余处理；反硝化细菌数量在作物生育中后期则以掺混80%～100%控释氮肥处理最高，其可能原因是中后期土壤硝态氮丰富，利于反硝化细菌生长，打破了氮转化菌群结构平衡，增强了土壤反硝化作用强度，加大氮素损失，降低氮素利用率［30］。综合来看，掺混40%控释氮肥处理既可以在作物生长前期提供维持作物生长所需的氮素水平，也可在作物快速生长的关键生育期提供大量氮素，充足的底物有效刺激了微生物的生命活动，提高代谢速率［31］。

土壤微生物群落和功能直接影响土壤酶活性，土壤酶催化土壤中各种生物化学过程，为微生物的生长繁殖建立基础［32-33］。土壤酶参与土壤肥力形成和演化的全过程［34-35］，施入土壤中的尿素仅在脲酶作用下水解，为植物提供氮源［36］；土壤蛋白酶能水解各种蛋白质和肽链化合物，与土壤氮素转换密切相关［37］。本研究显示，小麦和水稻全生育期脲酶和蛋白酶活性变化相似，呈现先上升后下降规律，这与冯爱青等［38］的研究结果类似，这可能是因为土壤酶主要来源于植物根系分泌物和土壤微生物［39-41］，而生育中期微生物活动旺盛，根系分泌物增多。本研究中，单施尿素T1处理明显增加了小麦、水稻分蘖期脲酶活性，但尿素水解过快易造成氮素的损失。掺混40%及以上控释氮肥处理脲酶活性在小麦拔节期明显提高，可能是因为控释氮肥延长了尿素水解周期，也可能受到了氮素功能菌的影响［42］。本研究对土壤蛋白酶活性分析表明，掺混40%控释氮肥在小麦、水稻分蘖至拔节期均高于掺混80%及以上控释氮肥处理，而在孕穗至成熟期三者均处于较高水平且差异不大，这可能是因为掺混40%控释氮肥处理在前期可利用相对较多的尿素水解供氮，在后期则利用适宜的控释氮肥延长肥效周期，以基本达到高比例掺混控释氮肥的效果，体现出较好的保肥效果，这与罗兰芳等［43］研究结果一致。与小麦季相比，水稻季土壤蛋白酶活性相对较高，这可能与蛋白酶在湿润条件下水解能力较高有关。王淑英等［44］研究表明，土壤微生物活动的增强促进酶活性的提高，本研究发现，小麦、水稻拔节至成熟期土壤氮转化细菌和酶活性均以掺混40%～100%控释氮肥处理较好，其变化趋势大体一致，与陶磊等［45］研究结果类似。可见，相较其余施氮处理，掺混40%及以上控释氮肥处理不仅能有效提高作物生育中后期土壤脲酶活性，蛋白酶活性也处于较高水平，有效促进土壤氮素转化。

4 结论

本试验条件下，掺混20%～80%控释氮肥处理利于小麦、水稻生育中后期土壤细菌、放线菌、真菌数量和酶活性的提高，掺混40%及以上控释氮肥处理有效提高小麦、水稻生育关键期土壤氮转化细菌数量。掺混40%控释氮肥T4处理综合效果较佳，利于减少作物前期氮素损失，促进氮素转化和养分循环，能有效解决养分释放与保贮的矛盾。