一例耐药大肠杆菌仔猪腹泻病诊断及中药治疗报告

姜玲玲 杨丽娟 唐远江 卢昱希 徐景峨 余波 张杨子

（贵州省农业科学院畜牧兽医研究所 550005）

仔猪腹泻是严重威胁仔猪生长的疫病之一，我国仔猪腹泻全年平均率为46.5%，给养猪业带来了巨大的经济损失。仔猪腹泻是一种多因素性疾病[1]，引起腹泻的细菌性病原有大肠杆菌、沙门氏菌、魏氏梭菌、猪痢疾密螺旋体等；病毒性病原以猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒感染为主[2]；某些寄生虫性病原也会引起仔猪腹泻[3]。其中产肠毒素性大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC） 是引起人和幼畜（出生仔猪、羔羊、断奶仔猪） 腹泻的主要病原[4-5]。2001 年贵州省仔猪腹泻发病率为54.8%[6]，给养殖业带来严重的经济损失。黏附素是其重要的致病因子，黏附素能与动物的小肠黏膜上皮细胞上的受体结合是ETEC 定居、繁殖，继而产生肠毒素致病的首要条件。因大肠杆菌菌株血清型多，疫苗防治效果不好，临床上常用抗生素控制该病[7]，但抗生素只能抗菌，不能控制肠毒素，细菌被抗生素杀死后会造成内毒素在肠道内释放，导致内毒素性休克、全身性炎症反应综合征及多器官功能障碍等一系列问题，另一方面，随着养殖场不合理用药，导致细菌耐药严重[8]，抗生素残留引起的食品安全问题给社会带来严重影响。中草药有无残留、不易产生耐药性，利用我国特有的中医理论和丰富的中药资源研发控制仔猪腹泻已被国内外专家所重视。

本报告通过流行病学调查，病理解剖和实验室诊断最终确诊为大肠杆菌性病原，采用石苦秦止痢散治疗后痊愈。现将石苦秦止痢散治疗仔猪大肠杆菌性腹泻报告如下。

1 材料与诊断方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

贵州大方县某养殖户，发病18 头，死亡3 头，送实验室检测4 头。

1.1.2 试验试剂

氯化钠 （成都金山化学试剂有限公司），胰蛋白胨（Oxoid），酵母提取物（Oxoid），琼脂粉（Solarbio），营养肉汤培养基（杭州微生物试剂有限公司），麦康凯营养琼脂培养基（广东环凯微生物科技有限公司），2×TaqMaster Mix 和Goldview（天根生化科技有限公司），DL1000 Marker （Takara），琼脂糖（Spain），TRIzol 试剂、SuperScriptIII 反转录酶试剂盒为Invitrogen 公司产品。石苦秦散由贵州省农业科学院畜牧兽医研究所、成都乾坤动物药业有限公司提供；石苦秦散包装规格：100g/袋；由石榴皮、苦参、秦皮经水提后喷雾干燥制得；批号：20180520。主治：仔猪黄白痢。

1.1.3 试验仪器

超纯水系统，ATZ-10-T，艾科浦U 系列纯化水机，台湾；PCR 扩增仪，Biometra T-Gradient Thermoblock，德国；低温离心机，Thermo Fisher Scientific Sorvall Legend Micro 21，美国；微量移液器，Eppendorf，德国；低温冰箱，-20℃，美的，中国；水平电泳槽，DYY-III，北京六一仪器厂，中国；立式压力蒸汽灭菌器，Boxun，中国；洁净工作台，SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司，中国；恒温振荡器，THZ-98A，上海一恒科学仪器有限公司，中国；核酸提取仪，Lab-Aid820，厦门百维信生物科技有限公司，中国。

1.2 诊断方法

1.2.1 临床症状

养殖场5 月起断断续续出现仔猪腹泻情况，发病仔猪多为5～10 日龄，出生后未出过圈舍。腹泻仔猪精神沉郁或萎靡，反应迟钝，发抖，被毛粗乱无光泽，地板被粪便严重污染，拉黄色或灰白色稀粪，粪便中有胃消化乳糜颗粒，肛部污染严重，不愿采食。个别腹泻严重的3～5d 后死亡。

1.2.2 病理解剖

对病死仔猪进行解剖学观察，仔猪消瘦，尸体苍白，肠道有黄白色内容物呈油膏状，胃肠鼓气，肠管扩张，肠壁变薄，肠黏膜淋巴结肿大，个别仔猪心包积液，肝、肾肿大。

1.2.3 实验室诊断

1.2.3.1 病毒性病原的检测

采用3 重PCR 方法检测常见的腹泻病毒，分别是猪流行性腹泻（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV） 的。具体操作如下：取高压灭菌的棉拭子采取送检的4 头腹泻仔猪肛门内直肠粪便，加入0.1M 的PBS 稀释，反复冻融两次后于12000g 离心15min，按照TRIzol 说明书提取总RNA，然后按照SuperScriptIII 反转录酶试剂盒说明书进行反转录，获得cDNA 为检测模板，采用贵州大学PEDV、TGEV、PoRV3 重PCR 方法[9]进行检测。结果见附表。

附表 腹泻病毒引物序列

PCR 反应体系：2×TaqMaster Mix 12.5μL，PEDV、TGEV、PoRV 上下游引物各1μL，cDNA 模板2μL，用dd H2O 补至25μL。PCR 反应条件为95℃3min，94℃30s，51℃30s，72℃45s，35 个循环，72℃延伸10min。取扩增产物8μL 经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3.2 细菌分离与鉴定

（1） 细菌的培养

用无菌棉拭子取送检的4 头腹泻仔猪肛门内粪内容物，将上述病料在麦康凯培养基上划线后置于37℃恒温箱培养24h后，挑取红色不透明单个菌落，于普通琼脂平板上划线进行纯培养24h 后，将平板放置于4℃中保存。

（2） 细菌的革兰氏染色鉴定

根据文献选择合适的革兰氏染色方法[10]，按革兰氏染色常规步骤进行染色、镜检。

1.2.3.3 细菌的PCR 鉴定

（1） 核酸提取仪提取菌液DNA

具体操作如下：取腹泻仔猪粪便内容物1g，加入5ml 灭菌生理盐水，充分混匀后于4000r/min 离心15min，弃沉淀，将上清转移到新EP 管，于12000r/min 离心5min，收集沉淀，吸弃上清，加入30μLDTT 溶液 （1mol/L），将溶液转移至Lab-Aid820 核酸提取仪进行自动提取。

（2） PCR 鉴定

引物序列参照文献[11]，上游5'-GCAATAAGGTTGAGGTGAT'-3，下游5'-GCCTGCAGTGAGAAATGGAC-3'。PCR 反应体系：2×TaqMaster Mix 12.5μL，上下游引物各1μL，2μL 模板，用dd H2O 补至25μL。PCR 反应条件为95℃5min，94℃30s，54℃45s，72℃1min，30 个循环，72℃延伸10min。目的片段为368 bp。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 PEDV、TGEV、PoRV3 重PCR 和大肠杆菌PCR 电泳检测

采用3 重PCR 方法检测猪流行性腹泻（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪轮状病毒（PoRV） 3种常见的腹泻病毒，如图1 的1～4 号，结果3种病毒均为阴性，说明该养殖场仔猪腹泻不是病毒性感染；图1 的5～8 为产肠毒素性大肠杆菌PCR 检测，结果可见4 只猪均检测出明显的条带，与目的条带368bp 相符，表明该猪场腹泻由产肠毒素性大肠杆菌引起。

2.2 大肠杆菌革兰氏染色图片

实验室通过PCR 分子生物学检测样品可能为大肠杆菌感染，为进行确诊，对细菌分离纯化培养后进行革兰氏染色镜检，结果如图2，可见检测细菌为革兰氏阴性杆菌，染色后为红色，形态呈单个存在、短小的杆状。与大肠杆菌形态相符[12]。

图1 样品PCR 检测结果

图2 大肠杆菌革兰氏染色镜检（10×10 倍）

3 治疗与讨论

本报告通过流行病学调查，排除寄生虫性病原感染，通过多重PCR 方法检测病毒性病原均为阴性，通过病理解剖和实验室诊断最终确诊为大肠杆菌性病原根据实验室诊断，确诊为大肠杆菌引起的腹泻，结合畜主诉说抗生素治疗效果不佳的现状，项目组最终采用石苦秦止痢散进行治疗。治疗方法：仔猪0.5g/kg，每天两次，石苦秦散中药用为温开水溶解后，直接人工灌胃，治疗第3 天时，1 头仔猪已基本不腹泻，其余3 头腹泻明显减轻，第5 天，4 只仔猪均不腹泻，治愈良好。

大肠杆菌可引起不同日龄段仔猪腹泻，根据仔猪排黑白色粪便可初步判定是大肠杆菌引起，PCR 检测结果再次确诊该养猪场感染产肠毒素性大肠杆菌。袁万哲等[13]研究表明，产肠毒素性大肠杆菌（ETEC） 是引起仔猪腹泻的主要病原，文献表明贵州分离的333 株大肠杆菌，其中猪源产肠毒素大肠杆菌占77%[14]。贺丹丹[15]等对不同动物源大肠杆菌的耐药性进行调查表明，健康猪对2 种或多种抗菌药物有耐药性，多重耐药性的增加必然会导致联合用药的效果降低，从而影响临床治疗效果，增加治疗成本。本诊断结果表明，当前抗生素治疗仔猪腹泻已达不到明显效果，本治疗方案最终使用的石苦秦止痢散治愈4 头仔猪，表明该复方制剂能有效治疗仔猪腹泻，而且对耐药性大肠杆菌引起的腹泻有良好效果，这为中草药防治仔猪腹泻提供理论依据。

仔猪腹泻是多种因素导致，增加了诊断和防治难度，本次实验室采用多重PCR、普通PCR 结合传统细菌分离鉴定技术对大肠杆菌性腹泻进行确诊，发现猪场耐药细菌存在普遍，为了减少耐药性细菌的产生，用药过程中要严格掌握，尽量避免长期使用同一种药物，不滥用抗生素，适当条件下选择中草药治疗可以达到更好的治疗目的。