EGCG恢复Sirt-1拮抗高糖诱导的PC12细胞凋亡

袁 晖，朱明亮，闫国防

(中国人民解放军第一六九医院 神经外科，湖南 衡阳 421000)

高糖微环境会导致神经细胞的病理生理变化，如自噬，内质网应激[1]等，诱导神经细胞凋亡，导致神经系统中枢性及周围性病变，危害人类的健康。表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)是绿茶中提取的多酚的活性成分，对细胞具有保护作用，如缓解氧化应激[2]，抑制脂质聚集，减轻自噬[3]等，在神经系统化方面，在促进神经细胞修复，抗炎等方面具有积极的作用。

Sirt-1是依赖于NAD+的组蛋白去乙酰化酶，在生物体中广泛存在并调节细胞的存活。Nagar等发现Sirt-1能够介导因氧化应激引起的细胞损伤的保护作用[4]；在神经研究方面，Sirt-1能够介导缺血再灌注脑损伤的神经保护作用[5]，因此，我们联想到，EGCG发挥对神经细胞凋亡的保护作用，Sirt-1是否参与其中。我们实验发现，EGCG对高糖诱导的神经细胞的损伤提供了一定的保护作用，Sirt-1介导其中。这些研究结果为糖尿病神经细胞损伤的药物研究提供了思路，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞培养方法 PC12细胞的培养使用DMEM(Hyclone)培养基加入10%胎牛血清(Gibico)，于27℃，5%CO2恒温培养箱中孵育维持。取对数期细胞根据实验需要，种植于6、24及96孔的实验板(Corning)中进行培养、观察及提取蛋白。

1.2 Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测PC12细胞的活性 取对数期细胞种植于96孔板，待细胞密度约75%时加入相应浓度的药物处理细胞，每一浓度至少3个实验样本，孵育24 h后，试验孔内加入10 μL的CCK-8试剂(Solarbio)，孵育2 h，使用酶标检测仪450 nm观察OD数值，并统计分析。

1.3 ELISA法检测Bcl-2的表达活性 取对数期细胞加入对应浓度的药物处理细胞24 h，提取细胞蛋白并定量。按照ELISA试剂盒(Invitrogen)中的说明书配置试剂：以每孔100 μL将细胞蛋白加入酶标板内，覆膜于摇床上室温进行3 h孵育，除去酶标板内液体使用1×洗涤液清洗2次，每孔加入1×活性液200 μL，酶标检测仪450 nm观察OD数值，并统计分析。

1.4 免疫荧光检测细胞胞质Caspase-3及胞核DAPI的表达 对数期细胞种植于24孔板，待细胞密度约75%时加入对应浓度的药物，孵育24 h，PBS清洗1次，冰甲醇固定10 min。加入Caspase-3一抗(Abcam)，室温孵育1 h；PBS清洗2次，加入荧光二抗(Solarbio)室温避光孵育1 h；PBST清洗1次，加入DAPI，室温孵育2 min。荧光显微镜10×40倍率观察并拍照。

1.5 Western-Blot法检测Sirt-1的表达 取对数期细胞加入对应浓度的药物处理24 h，提取细胞蛋白并定量。使用凝胶进行蛋白电泳，PVDF膜采用半干法转膜30 min；TBST加入5%脱脂奶粉常温封闭2 h，加入Sirt-1一抗(Abcam)封闭孵育12 h，TBST清洗3次，加入二抗(Cell Signaling)摇床孵育2 h，TBST清洗3次后使用成像仪显影。

1.6 统计分析 采用SPSS 18.0进行统计分析，数据采用平均数±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析(One-way ANOVA)中的最小显著差异检验(LSD-test)，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高浓度葡萄糖诱导PC12细胞的凋亡 使用不同浓度的葡萄糖(15、 30、 45 mmol/L)处理PC12细胞24 h，结果发现，PC12细胞的活性随葡萄糖给予浓度的递增而下降(图1A，F=2.36，P<0.05)，较对照组分别下降了14%、32%及57%；使用ELISA法检测了Bcl-2的表达，由图1B可见，具有抑制凋亡作用的Bcl-2蛋白的表达呈现了同样的趋势(图1B，F=11.05，P<0.05)，较对照组分别下降了8%、30%及35%；为了更直观地观察细胞凋亡的发生，我们采用免疫荧光观察细胞质中凋亡蛋白家族的成员Cleaved-Caspase3的表达活性，由图1C中红色荧光染色的Cleaved-Caspase3可以观察到，葡萄糖处理后的PC12细胞的胞质中，红色荧光聚集密度较对照组有明显增加，与处理浓度呈现一定的相关性。此外，我们使用DAPI对细胞核进行了染色，葡萄糖损伤组的荧光强度增高，以上表明，高浓度葡萄糖对PC12细胞造成了明确的损伤。

2.2 EGCG保护高糖诱导的PC12细胞的凋亡 与葡萄糖30 mmol/L损伤组相比，加入EGCG(10、20、40 μmol/L)对细胞活力提升具有积极的作用，细胞活性较损伤组分别提升了2%、20%及24%，细胞活力的提升率与EGCG浓度呈现正相关(图2A，F=1.98，P<0.05)，而单独使用EGCG对PC12细胞活力无明显影响；加入EGCG处理后，Bcl-2的表达分别提升了10%、22%和25%，20 μmol/L浓度以上的EGCG对Bcl-2的表达具有明确的统计学意义(图2B，F=23.67，P<0.01)；由图2C可以观察到，胞质中红色荧光染色的Cleaved-Caspase3在加入EGCG保护组中的荧光强度和密度，相比较损伤组有一定程度的减弱。以上结果表明，EGCG对高糖诱导的细胞损伤具有保护作用。

2.3 EGCG拮抗高糖对Sirt-1表达的抑制 与对照组相比，葡萄糖损伤组抑制了Sirt-1的表达，加入EGCG后则一定程度恢复了Sirt-1的表达，单独使用EGCG则对Sirt-1表达影响的差异无统计学意义(图3，F=14.71，P<0.01)。

A.CCK-8检测PC12细胞活力；B.ELISA法检测Bcl-2的表达；C.免疫荧光观察胞核内Cleaved-Caspase3表达活性，观察胞核中DAPI的表达。

A.CCK-8检测PC12细胞活力；B.ELISA法检测Bcl-2的表达；C.免疫荧光观察胞核内Cleaved-Caspase3表达活性，观察胞核中DAPI的表达。**P<0.001，*P<0.01，vs. 对照组；&&&P<0.001，&&P<0.01，&P<0.05，vs. 葡萄糖损伤组(Glu 30 mmol/L)。

2.4 Sirt-1阻断剂Sirtinol逆转了EGCG对PC12细胞的保护作用 通过预实验发现浓度为15 μmol/L的Sirtinol在不明显损伤细胞的同时能对Sirt-1发挥较好的阻断作用。由图4可以得知，加入Sirtinol与EGCG同时处理组的细胞活性较EGCG保护组下降了8%(F=1.59，P<0.05)，Bcl-2的表达下降了16%(F=37.96，P<0.01)；Cleaved-Caspase3在胞质中的荧光强度也出现了对应的增高，提示Sirt-1介导了EGCG对PC12细胞的保护作用。

A.CCK-8检测PC12细胞活力；B.ELISA法检测Bcl-2的表达；C.免疫荧光观察胞核内Cleaved-Caspase3表达活性，观察胞核中DAPI的表达。

3 讨论

相关实验证实，持续的高糖微环境会导致神经细胞的凋亡，出现一系列神经细胞损伤引起的并发症，危害人们的健康及生存质量。因此寻求高糖环境下神经细胞的保护作用并改善损伤显得尤为重要。为此，我们通过实验发现：EGCG对高糖诱导的神经细胞损伤提供了较为积极的保护作用，Sirt-1介导了这种保护作用。

EGCG是绿茶多酚的活性成分，既往研究表明其具有强大的抗氧化作用[2]，保护细胞的DNA免受损害，同时在心脑血管、神经保护方面发挥了积极的作用，机制涉及抗氧化应激，抑制内质网应激[1]等；此外，还有研究表明，EGCG具有抗病毒[6]、抗炎、抑制肿瘤[7]等功效，机制涉及抑制肿瘤相关酶的活性从而抑制增殖，诱导癌细胞凋亡等。

为明确高糖微环境对神经细胞的损伤及EGCG提供的保护作用，我们使用PC12细胞模拟神经细胞，PC12来源于小鼠嗜铬细胞瘤，具有类神经细胞的生物特性及分泌能力，是神经病理生理研究公认的理想实验对象[8]。我们采用不同浓度的葡萄糖(15、 30、 45 mmol/L)处理PC12细胞，通过检测细胞活力，凋亡保护蛋白Bcl-2的表达客观评估细胞的存活情况；Caspase3在胞质内被磷酸化，活化后的Caspase3通过对DNA修复酶的剪切启动细胞的凋亡程序，是公认为评估凋亡的可靠指标[9]，我们采用免疫荧光法分别标记细胞质内活化的Caspase3以及胞核内DAPI的表达，以直观地感受细胞凋亡发生时，凋亡相关指标的表达强度。结果表明高糖微环境诱导了神经细胞的凋亡。接下来，我们通过加入EGCG，并与损伤组相比较来评估其提供的神经细胞保护作用，同样通过检测凋亡相关指标，我们发现EGCG对高糖诱导的神经细胞凋亡提供了较为可观的保护作用，与我们的预期相一致。

此外，我们进一步探讨了Sirt-1在细胞保护中的介导作用。Sirt-1被许多科学家称为“长寿基因”，正是由于其参与了细胞的分化、代谢，进而调节细胞寿命，并决定了细胞的存活[10]。有研究证实：Sirt-1在许多神经退行性变中扮演了保护者的角色[11]。在我们的实验中，我们发现EGCG不仅具有提升Sirt-1的表达、逆转高糖对Sirt-1的抑制作用，而且使用Sirt-1特异性阻滞剂Sirtinol后，EGCG的保护作用被逆转，这些都表明，Sirt-1介导了EGCG对PC12细胞的保护作用。此外，单独使用Sirtinol对细胞活力也产生了轻微的抑制作用，具有统计学意义，提示Sirt-1可能还通过其他通路介导和发挥了细胞的保护作用。然而，EGCG对高糖诱导的神经细胞的损伤的更深入的机制，以及其他应激及保护方面的研究仍需进一步探索。

通过实验，我们证实EGCG能够通过Sirt-1的介导从而提供对高糖诱导的PC12细胞的保护作用，这为高糖诱导的神经系统病变提供了新的思路。基于我们的研究，运用EGCG为神经病变提供保护或许是新的策略与方法，也为神经系统病变的治疗提供了新的视角。