棕榈酸对肝细胞自噬和凋亡的影响

杜 卉，张 扬，孟祥健，吕康甲，吴晓莉，王李卓，邢春燕，何春玲，高家林

(1.皖南医学院第一附属医院 弋矶山医院 内分泌科,安徽 芜湖 241001;2.皖南医学院 a.临床医学院;b.生物化学与分子生物学教研室,安徽 芜湖 241002)

自噬和凋亡是真核生物体内两种重要的生理过程。自噬是体内物质降解的重要途径，借助具有双层膜结构的自噬小泡，将降解底物运送至溶酶体内降解。多种体内外刺激因素引起内环境改变，使自噬上游调控通路被激活，ULK1/ULK2复合体活化使自噬起始，随后在Beclin1-Vps34-Vps15复合体的作用下成核，借助Atg12-Atg 5系统和LC3修饰这两个泛素样系统调控自噬体膜的形成和延伸，最终形成自噬体并与溶酶体融合，底物进入溶酶体内降解，形成一个完整的自噬过程。细胞内破损或衰老的细胞器、错误合成或错误折叠的蛋白质等可以通过自噬被降解，从而维持细胞内的相对稳定。凋亡也是体内促进细胞数量相对稳定的自我平衡机制，同时可以发挥防御功能，凋亡通过caspase家族发挥作用，通过级联反应导致细胞核固缩、DNA断裂和细胞核的崩解，最终形成凋亡小体被周围细胞吞噬。自噬和凋亡参与癌症发病[1- 2]，脂性凋亡[3]和脂质自噬[4]，在脂质诱导机体病变的过程中发挥重要作用。

棕榈酸为饱和脂肪酸，对于脂质代谢相关疾病的发病具有重要意义，饱和脂肪酸摄入过多能够增加心血管疾病的发病风险[5]，前期研究中发现脂质和自噬及凋亡有密切联系，所以我们希望明确棕榈酸对于自噬和凋亡的具体影响，从而进一步明确脂质与自噬和凋亡的关系，指导相关疾病的防治。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 小鼠正常肝细胞(AML12细胞)购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)，人肝癌细胞(HepG2细胞)购自中国科学院细胞库。棕榈酸处理前细胞均经过1%FBS培养基预处理。

1.1.2 主要材料与试剂 棕榈酸钠购自Sigma公司；无脂肪酸牛血清白蛋白购自生工生物公司；AML12细胞完全培养液(SCSP-654)购自中国科学院细胞库；p-mTOR、Atg5、p-erk均购自Cell Signaling Technology；Bcl2购自Proteintech；LC3B、β-actin购自美国Sigma公司；P62购自Abcam公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)、辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)及DAPI染色液购自碧云天公司；化学发光底物和彩色预染蛋白质分子量标准(10～180 ku)购自赛默飞世尔科技；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒购自北京索莱宝公司；甲醇(AR)购自国药集团化学试剂有限公司，实验用水均为超纯水(产自Millipore超纯水系统)。

1.2 方法

1.2.1 药物配制 用甲醇配制棕榈酸钠母液，用含1%无脂肪酸牛血清蛋白的完全培养液稀释至所需浓度。

1.2.2 CCK8法检测细胞活力 细胞接种于96孔板，37℃，5%CO2预培养24 h，向孔内加入10 μL不同浓度棕榈酸溶液，培养箱内孵育8 h，更换新鲜培养基，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育4 h，酶标仪测定450 nm处吸光度。

1.2.3 DAPI染色 吸弃培液，PBS漂洗1次，加入适量DAPI染色液室温避光染色5 min，吸弃DAPI染色液，PBS清洗3次，每次5 min，在半智能荧光倒置显微镜下观察。

1.2.4 western blotting 检测蛋白水平 处理后的贴壁细胞，PBS洗涤后加入适量蛋白裂解液，将细胞收集至洁净的1.5 mL EP管，细胞破碎仪破碎细胞后于冰上静置30 min，随后4℃、12 000 r/min离心15 min，上清即为细胞总蛋白。按照蛋白60 μg/孔上样，SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，封闭，一抗4℃孵育过夜，1×TBST洗涤3次，每次10 min，二抗室温孵育1 h，1×TBST洗涤3次，每次10 min，ECL发光法显影。

1.2.5 统计学处理 利用Microsoft Excel 2007、SPSS 16.0和GraphPad Prism 5软件处理数据，数据分析采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 western blotting检测棕榈酸对细胞的影响 不同浓度的棕榈酸溶液孵育HepG2细胞8 h,检测自噬及凋亡相关蛋白的表达。mTOR是自噬调控蛋白，mTOR被抑制时，Atg13去磷酸化，形成ULK1-Atg13-FIP200复合物，促进吞噬泡的形成；而Atg12-Atg5-Atg16复合物和LC3Ⅱ能够促进自噬体形成，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比例与自噬泡的数量正相关。实验结果显示从棕榈酸浓度达到200 μmol/L开始，p-mTOR下降，Atg5增加，LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ增加，表明自噬开始增强，可能由于棕榈酸使自噬降解底物基数增加，所以P62表达也增加，与此同时，p-erk表达增加，表明棕榈酸可能通过Erk1/2通路发挥作用,同时发现Bcl2在棕榈酸处理后表达增加(图1、表1)。

2.2 CCK-8检测棕榈酸对细胞活力的影响 不同浓度棕榈酸处理细胞，CCK-8试剂盒检测细胞活性，CCK-8可在电子载体的作用下被细胞中的脱氢酶还原为水溶性的黄色甲臜产物，OD值越大，则活细胞数量越多，在实验中发现随着棕榈酸浓度增高细胞数量不断减少(图2)。

图1 western blotting检测棕榈酸对细胞的影响

表1 棕榈酸对细胞中自噬相关蛋白的影响

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

图2 不同浓度棕榈酸对AML12细胞活力的影响

2.3 棕榈酸处理不同时间对细胞的影响 根据图2浓度作用曲线选取200 μmol/L的棕榈酸作用于细胞，观察不同作用时间对细胞的影响，结果显示随着作用时间延长，细胞活力不断下降，存活细胞不断减少(图3)。

2.4 DAPI染色检测棕榈酸对细胞的影响 用200 μmol/L棕榈酸作用于AML12细胞，DAPI染色检测细胞核变化，结果显示棕榈酸处理后细胞核染色加深、变亮，提示核固缩(图4)。

200 μmol/L的棕榈酸分别作用于细胞0、6、8、12 h后细胞数量(20×)

A.正常培养的AML12细胞细胞DAPI染色(20×)；B.棕榈酸处理后的AML12细胞DAPI染色(20×)。

3 讨论

非酒精性脂肪肝病是常见的慢性疾病，流行病学研究显示，在工业化国家中约有14%～27%的人口患有非酒精性脂肪肝病[6]，非酒精性脂肪肝病已经成为慢性肝病最常见的原因[7]，但同时研究也表明非酒精性脂肪肝病在一定程度上是可逆的，肥胖病患者在进行减肥手术后不仅肝脂肪变能够得到好转[8]，肝纤维化的比例也有所下降[9]，由此可见肥胖与非酒精性脂肪肝病的发病关系密切，而肥胖人群中脂肪酸的含量，则被证明是影响脂肪肝最重要的因素[10]。脂肪酸分为饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，而饱和脂肪酸是引起非酒精性脂肪肝病进展的重要原因，饱和脂肪酸能够诱导JNK依赖性的肝细胞脂性凋亡[11]，明确饱和脂肪酸对机体的影响，对于进一步的疾病预防和治疗具有重要意义。

许多蛋白、因子被发现可以通过影响自噬过程来改善或加剧NAFLD的进程[12]，有研究显示在肝细胞中棕榈酸能够通过活化JNK2通路激活自噬[13]，种种研究显示饱和脂肪酸影响NAFLD的机制和自噬与凋亡密切相关，因此，了解饱和脂肪酸影响自噬和凋亡的机制十分必要。棕榈酸属于饱和脂肪酸，研究棕榈酸对于肝细胞的作用能够很好地帮助我们了解饱和脂肪酸影响肝脏的机制。

我们检测了HepG2细胞在不同浓度棕榈酸作用下自噬的变化，发现p-mTOR下降、Atg5及 LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ增加，说明自噬活化增加，P62增加可能是由于底物总量过多导致的。实验结果说明棕榈酸能够激活自噬，但到达一定浓度后再增加棕榈酸浓度自噬活性并不会随之增高。Erk1/2能够作用于mTOR继而影响自噬，因此棕榈酸对于自噬的影响可能是通过抑制Erk1/2通路，使p-mTOR下降，进而激活自噬下游通路而实现的；此外我们也发现Bcl2表达增加(图1)，Bcl2一般被认为是抗凋亡蛋白，可以抑制细胞色素C的释放，从而阻止凋亡的发生；同时，Bcl2能与Bcl2家族的促凋亡蛋白形成异二聚体保护细胞不进入凋亡程序[14]。

考虑到癌症与凋亡的密切联系[15]，我们选择小鼠正常肝细胞检测凋亡的改变。CCK-8结果显示随着棕榈酸浓度升高细胞存活率不断下降(图2)，延长棕榈酸作用的时间，存活细胞不断减少(图3)，用DAPI染色发现棕榈酸处理后细胞核致密、浓染，说明细胞凋亡增加；但在前期实验中发现抗凋亡蛋白Bcl2在棕榈酸处理后增加，我们猜想可能是棕榈酸介导的细胞凋亡并不主要由Bcl2调节。另有文献报道Bcl2家族中促凋亡蛋白及抗凋亡蛋白的表达程度并非是决定细胞凋亡的唯一因素[16]，因此细胞凋亡的程度与Bcl2的表达量可能不完全一致。总之，通过实验我们确定棕榈酸可以促进细胞凋亡，同时通过Erk1/2信号通路途径来激活自噬。