输出蛋白5的表达与肝细胞癌患者临床病理特征及预后的关系

陈嘉飞，周武汉，王金桂

（福建省莆田市第一医院 肝胆胰脾外科，福建 莆田 351100）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的致死性肿瘤，据报道每年有约750000新发HCC病例，过去几十年随着诊断技术和手术的进步，HCC患者的预后有一定提高，但5年生存率也仅有26%[1]。肝硬化及乙肝病毒导致的慢性炎症是导致HCC发生的主要因素[2]。目前，大部分HCC患者在确诊前已经发展为远处转移，只有少部分患者具有有效的治疗手段[3]。因此，研究HCC发生发展机制，寻找新的早期诊断和预后指标仍是研究的重点。

输出蛋白5（exportin 5，XPO5）是一类在大多数生物体内非编码小RNA前体（pre-miRNA）转运受体所必须的受体蛋白，主要负责转运premiRNA从细胞核进入到细胞质[4-5]。据报道[6]，碳末端的突变引起XPO5蛋白失活导致包括结肠癌、胃癌和子宫内膜癌中微卫星不稳定性。有研究[7-9]表明XPO5基因3'端非翻译区的rs11077单核苷酸多态性会增加肾癌、结肠癌的患病风险，并与非小细胞肺癌患者预后显著相关。这些研究结果提示，XPO5基因可能参与调控肿瘤的发生发展。然而XPO5蛋白在HCC中的表达及其与临床病理特征间的关系尚不清楚。本文通过研究XPO5蛋白在HCC组织中的表达，探讨了XPO5蛋白表达与HCC患者临床病理因素间的关系及对预后的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集2014年1月—2015年6月在我院手术切除的HCC患者标本。纳入标准：⑴ 具有详细完整的临床病例信息；⑵ 所有病例均由病理医师确诊为HCC；⑶ 术前未经放化疗；⑷ 所有患者均行切除术，且切缘为阴性。剔除标准：病例随访资料或临床病例信息不全者。手术后通过电话或门诊随访获得肿瘤复发和总生存时间，随访到2018年6月截止，共得到HCC标本92例。组织标本经手术切除后迅速分块，部分经过福尔马林固定后包埋于石蜡中，一部分放入-80 ℃冰箱保存备用。采用液氮研磨法提取标本中蛋白行Western blot实验。通过石蜡切片制作4 μm切片行免疫组化检测XPO5蛋白在组织样本中的表达。

1.2 主要试剂

总蛋白提取试剂RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒及电泳溶液、超敏ECL化学发光试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。GAPDH兔抗人单抗、XPO5兔抗人单抗、山羊抗兔HRP偶联标记的二抗均购于美国Cell Signaling Technology公司。免疫组化MaxVisionTM试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 Western blot检测

-80 ℃冰箱冻存的组织标本经研磨后加入RIPA裂解液提取蛋白，采用BCA法测定蛋白浓度，取相同总量（30 μg）蛋白加入等体积2×电泳加样缓冲液煮沸10 min。经SDS-PAGE凝胶电泳分离后，浓缩胶50 min，分离胶1 h，转印到PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭30 min后，加入XPO5（1:300）或者GAPDH（1:300）一抗4 ℃孵育过夜，室温下漂洗3次。37 ℃孵育辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗1 h，漂洗3次后，采用ECL化学发光试剂盒显影蛋白条带。

1.4 免疫组化检测

免疫组化实验步骤按免疫组化试剂盒说明书步骤进行。组织石蜡切片于67 ℃烘片2 h，经二甲苯和梯度酒精脱蜡至水。抗原修复方法采用柠檬酸盐缓冲液微波煮沸修复，自然冷却后加入阻断剂阻断内源性过氧化物酶活性，PBST清洗3次。3% BSA封闭1 h后直接滴加XPO5一抗稀释液（1:300），4 ℃孵育过夜，漂洗3次。37 ℃孵育二抗1 h，PBST清洗3次。DAB显色试剂显色，当目标蛋白出现显色且相对较弱时终止显色。根据阳性细胞百分比及显色深浅分级，表达强度用组织学评分（∑pi）表示：p代表同一染色强度细胞所占计数细胞百分数（即阳性细胞百分率），无细胞显色或阳性细胞百分数＜5%为0，5%～35%细胞显色为1，36%～65%细胞显色为2，＞66%细胞显色为3；i代表细胞浆显色深浅或染色强度，不显色或显色不清为0，浅黄色为1，棕黄色为2，深褐色为3。将所有HCC组织标本按评分高低分为高表达组及低表达组，即评分总和≤3分为低表达组，＞3分为高表达组。

1.5 统计学处理

采用SPSS20.0统计软件，实验数据以均数±标准差（±s）表示，统计处理采用独立t检验对组间进行比较；计数资料采用χ2检验。患者总生存率和无瘤生存率均采用Kaplan-Meier分析，单因素和多因素分析采用Cox回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Western blot检测XPO5在HCC组织中的表达

Western blot检测结果显示，XPO5蛋白在HCC组织中的表达量均高于其对应癌旁组织（图1）。

图1 Western blot检测XPO5蛋白表达 N：癌旁组织；T：HCC组织Figure1 XPO5 protein expression determined by Western blot N:Ajacent tissues; T:HCC tissue

2.2 免疫组化检测XPO5在HCC组织中的表达

免疫组化示，正常肝组织中XPO5表达强度低，其完全定位在细胞质中（图2A）；在HCC组织中，XPO5整体表达高于正常组织。其中XPO5低表达组织其主要定位在细胞浆，少部分有细胞核表达（图2B）；而在XPO5高表达组织，XPO5除了定位在细胞质中，细胞核也出现表达（图2C）。

图2 免疫组化XPO5蛋白表达（×100） A：正常肝组织；B：HCC组织XPO5低表达；C：HCC组织XPO5高表达Figure2 Immunohistochemistry staining for XPO5 protein expression (×100) A:Normal liver tissue; B:HCC tissue with low XPO5 expression; C:HCC tissue with high XPO5 expression

2.3 XPO5蛋白表达水平与HCC临床病理因素的关系

XPO5蛋白表达水平与患者性别、年龄、血清AFP水平、HbsAg及血管浸润、肿瘤部位和血管浸润无关（均P＞0.05），与肿瘤大小、分化程度、临床分期、远处转移及肝硬化有关（均P＜0.05）（表1）。

2.4 XPO5表达水平与HCC患者预后间的关系

XPO5低表达组1、5年无瘤生存率高于高表达组（78.5%vs.46.8%，37.4%vs.20.3%，均P＜0.01）；XPO5低表达组1、5年总生存率高于高表达组（91.2%vs.75.9%，58.8%vs.36.1%，均P＜0.01）（图3）。

表1 XPO5表达与HCC患者临床病理特征的关系[n（%）]Table1 Relations of XP05 expression with clinicopathologic features of HCC patients [n (%)]

图3 不同XPO5表达水平HCC患者的生存曲线Figure3 The survival curves of HCC patients with different XPO5 expression levels

2.5 影响HCC患者无瘤生存及总生存的危险因素分析

单因素和多因素Cox风险回归模型分析示，血管浸润（P=0.032）、远处转移（P=0.025）及X P O 5表达（P=0.036）均是影响H C C患者无瘤生存的独立危险因素（表2）；临床分期（P=0.012）、远处转移（P=0.028）及XPO5表达（P=0.013）是影响HCC患者总生存的独立危险因素（表3）。

表2 单因素及多因素分析HCC患者无瘤生存期相关的危险因子Table2 Univariate and multivariate analysis of risk factors for disease-free survival in HCC patients

表3 单因素及多因素分析HCC患者总生存期相关的危险因子Table3 Univariate and multivariate analysis of risk factors for overall survival of HCC patients

3 讨 论

HCC的发病存在明显的地域差异，在东亚国家包括中国和南非发病率尤其高[10]。在过去几十年，HCC手术切除后5年复发率高达50%～70%，导致HCC患者生存率仍很低[11-12]。

miRNA是一类非编码蛋白质的RNA，通过结合靶基因的mRNA导致其降解从而抑制基因表达[13-14]。miRNA的生物学合成过程涉及到多个步骤，包括由RNA聚合酶II对原miRNA（primiRNA）的转录，Drosha对pri-miRNA的剪切成pre-miRNA，再由XPO5将pre-miRNA由细胞核转运到细胞质中，经过Dicer酶的加工形成成熟的miRNA发挥基因沉默功能[15]。XPO5属于核转运蛋白β家族成员，其主要功能是将pre-miRNA从细胞核转运到细胞质中；XPO5在多种底物的核浆运输中发挥重要功能[5]。在细胞周期中，XPO5通过依赖于磷脂酰肌醇3-激酶转录后机制迅速提高细胞整体miRNA水平，抑制XPO5导致细胞增殖受抑制[16]。除了转运pre-miRNA外，有研究[17-19]证明XPO5还涉及到一些RNA结合蛋白的转运，比如Staufen同系物2、白介素增强结合因子3及核糖体60s亚基的运输。Lee等[20]发现，当XPO5功能异常后，相比于正常细胞系和组织，在肿瘤细胞系和组织中存在大量miRNA基因转录成pre-miRNA，但并不能形成成熟的miRNA。XPO5在肿瘤中异常表达也有报道，比如Chiosea等[21]发现XPO5在前列腺癌中高表达，Varambally等[22]也同样发现XPO5高表达于前列腺癌组织中，并与肿瘤转移相关。本研究发现，XPO5在HCC组织中的表达显著高于癌旁组织，这与之前在其他肿瘤中的报道[8-9]一致。然而，也有文献[23]报道XPO5在支气管肺泡癌中呈低表达状态。这种在不同肿瘤中的表达差异可能跟肿瘤特异性有关。Shigeyasu等[24]也发现XPO5在结肠癌组织中表达量显著升高，且XPO5高表达与患者恶性临床病理特征和预后差显著相关。本研究结合临床病理特征分析也同样发现，高表达XPO5的HCC患者与恶性临床病理因素呈正相关。Cox风险比例回归模型单因素和多因素分析提示，XPO5可作为判断HCC患者术后肿瘤复发和预后不良的独立风险因子。

Sun等[25]研究发现细胞外调节蛋白激酶的激活能够磷酸化XPO5，磷酸化的XPO5其构象发生改变，转运pre-miRNA的能力下降，导致细胞整体miRNA的水平下降并促进肿瘤发生。本研究仅限于XPO5表达与HCC患者临床病理参数的关联性研究，根据本研究结果发现XPO5在HCC中起到促进肿瘤进展的作用。结合之前的报道我们推测，在HCC中XPO5过表达的原因和可能的促癌功能有下几点。首先，XPO5可能存在基因突变导致翻译的蛋白功能丧失，HCC细胞会通过高表达该基因企图来弥补这部分丧失的功能；其次，HCC细胞高表达XPO5导致合成转运的促进肿瘤发生发展的miRNA更快的生物合成，加速肿瘤进展。

综上，XPO5在HCC组织中呈高表达，并与患者恶性病理特征及预后差相关。XPO5蛋白表达水平可作为判断HCC患者术后肿瘤复发和不良预后的重要指标，进一步深入研究XPO5在HCC中的作用机制将有望为寻找新的治疗靶点提供理论基础。