大叶胡枝子根皮提取物抗炎镇痛作用研究

钟卫华，梁生林



大叶胡枝子根皮提取物抗炎镇痛作用研究

钟卫华1，*梁生林2

（1．井冈山大学附属医院，江西，吉安 343000；2．井冈山大学医学部，江西，吉安 343009）

探讨大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药的抗炎镇痛作用。采用二甲苯致小鼠耳肿胀、蛋清致大鼠足跖肿胀2种急性炎症模型以及大鼠棉球肉芽肿慢性炎症模型，研究大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药对急慢性炎症的作用。采用热板法和醋酸扭体法致痛，研究大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药的镇痛作用。与模型组相比，大叶胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低剂量组显著抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀（< 0.01），明显抑制蛋清所致大鼠足跖肿胀（< 0.01），明显抑制大鼠棉球肉芽肿（< 0.01）。大叶胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低剂量组给药后明显提高热板所致小鼠的痛阈值，与模型组和自身给药前比较差异显著（< 0.05、0.01）；大叶胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低剂量组明显减少醋酸所致小鼠扭体反应次数，与模型组比较差异显著（< 0.05、0.01）。大叶胡枝子根皮水提物的抗炎镇痛作用强于醇提物（< 0.05、0.01）。大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药具有一定抗炎、镇痛作用，且其水提物强于醇提物。

大叶胡枝子根皮；提取物；抗炎；镇痛

大叶胡枝子（Franch.）为豆科（Leguminosae）胡枝子属（Lespedeza Michx.）植物，别名大叶乌梢、大叶马料梢、活血丹。其广泛分布于江西、浙江、湖南、广东、广西、贵州等地。以根、叶<入药，性平、味甘，具宣开毛窍、通经活络等功效，可用于疹痧不透、头晕眼花、汗不出、手臂酸麻等的治疗>[1-2]。现代研究表明，大叶胡枝子茎皮、根皮主要含黄酮类[3-5]，具有抗早孕[6]等作用。但有关大叶胡枝子根皮的抗炎镇痛作用未见报道。本研究采用小鼠耳肿法、大鼠足肿法及棉球法的炎症模型和小鼠热板法、醋酸扭体法疼痛模型来探讨大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药是否有抗炎镇痛作用，水提物和醇提物抗炎镇痛作用是否有差异，旨在为大叶胡枝子进一步开发利用和临床应用提供实验依据。入药，性平、味甘，具宣开毛窍、通经活络等功效，可用于疹痧不透、头晕眼花、汗不出、手臂酸麻等的治疗

1 材料

1.1 动物

清洁级昆明小鼠，体质量18~24 g，雌雄兼备； SD大鼠，清洁级，体质量180~250 g，雌雄各半，均由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0003。

1.2 药物与试剂

大叶胡枝子根皮采于江西吉安，经井冈山大学医学部药学系周秋贵副教授鉴定为豆科胡枝子属植物大叶胡枝子（Franch.）；阿司匹林片（拜耳医药保健有限公司（进口分装），规格0.1 g/片，批号BJ04931），盐酸吗啡注射液（东北制药集团公司沈阳第一制药厂，规格10 mg/mL ，批号160701-2），戊巴比妥钠（上海西唐生物科技有限公司，批号WS20160112），二甲苯（中国上海试剂一厂，批号20160201），36%醋酸（上海松江佘山化工厂）。

1.3 仪器

YLS-25A 电动耳肿打耳器（济南益延科技发展有限公司）；PV-200足肿容量测量仪（成都泰盟软件有限公司）；RB-200智能热板仪（成都泰盟软件有限公司）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHB-ⅢA循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；电热恒温干燥箱（上海新苗医疗器材制造有限公司）。

2 方法

2.1 大叶胡枝子根皮提取物的制备

2.1.1 水提物的制备

取切成小段的干燥大叶胡枝子根皮300 g，用纯化水浸泡0.5 h，加10倍量纯化水（第一次多加2倍量）用文火煎煮3次，第1次1 h，后2次各0.5 h，合并3次煎出液，静置去渣，置于旋转蒸发仪旋转蒸发浓缩为浸膏状，贮存于4℃下密封保存备用。

2.1.2 醇提物的制备

用回流提取法，将300 g干燥大叶胡枝子根皮适度粉碎，用80%乙醇浸泡24 h，水浴中加热回流提取3次，第1次回流1 h，第2及第3次各0.5 h，合并3次提取液，回收乙醇，减压蒸干，贮存于4℃下密封保存备用。

2.2 大叶胡枝子根皮提取物的抗炎实验

2.2.1 小鼠耳肿法[7-8]

将96只昆明种小鼠，按体质量和性别随机均分为8组：模型组（纯化水，10 mL/kg），阿司匹林（0.5 g/kg）阳性对照组，大叶胡枝子根皮水提物和醇提物（生药10.0、5.0、2.5 g/kg）组。大叶胡枝子的给药剂量参考全国中草药汇编成人每日用量25~50 g，换算成小鼠的剂量为5.0~10.0 g/kg。小鼠均灌胃给药，给药容量均为10 mL/kg，1次/d，连续给药5 d。末次给药1 h后每只小鼠左耳廓两面均匀涂抹100%二甲苯0.05 mL致炎，右耳作对照。1 h后脱颈椎处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用直径8 mm电动耳肿打耳器分别在左右耳同一部位冲下圆形耳片，电子天平称质量，以两耳片的质量差作为耳肿胀度，计算肿胀抑制率。

耳肿胀度＝左耳片质量－右耳片质量。

耳肿胀抑制率（%）＝（模型组耳肿胀度－给药组耳肿胀度）/ 模型组耳肿胀度×100%。

2.2.2 大鼠足肿法[7]

80只SD大鼠，雌雄各半，按体质量和性别随机均分为8组，具体分组方法及给药方法同“2. 2. 1”项。末次给药后1 h，每只大鼠左后足跖皮下注射10%蛋清生理盐水溶液（临用时新鲜配制）0.1 mL致炎，用容积法分别测定各鼠致炎前及致炎后1、2、4、6 h的足跖容积，记录结果，并计算肿胀率。

足肿胀率（%）＝（致炎后足跖容积－致炎前足跖容积）/ 致炎前足跖容积×100%。

2.2.3 大鼠棉球法[7]

大鼠分组同“2. 2. 2”项。大鼠用1%戊巴比妥钠5 mL/kg腹腔注射麻醉后，在每只鼠两侧腹股沟用碘伏消毒，75%酒精棉球脱碘后，各切1 cm长小口，用眼科镊将20 mg的灭菌棉球（10 g/L氨苄西林液浸泡，烘干）从切口处植入皮下，随即缝合皮肤。次日开始给药，给药途径及量同“2. 2. 2”项，连续给药7 d。第8天将大鼠脱颈椎处死，打开原切口，将棉球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，放电热恒温干燥箱60 ℃干燥24 h烘干，称质量。将称得的质量减去棉球原质量即得肉芽肿质量，计算肉芽肿抑制率。

肉芽肿抑制率（%）＝（模型组肉芽肿质量－给药组肉芽肿质量）/ 模型组肉芽肿质量×100%。

2.3 大叶胡枝子根皮提取物的镇痛实验

2.3.1 热板法[7-8]

热板加热至（55 ± 0.1）℃并恒定，把小鼠放置热板上，记录小鼠从放置热板至出现舔后足反应所需时间（s），小于5 s或大于30 s或跳跃的都弃之不用。取筛选合格的雌性小鼠96只，按体质量随机分为8组，每组12只，除阳性对照组为盐酸吗啡（0.02 g/kg）外，其余各组同“2. 2. 1”项。将每只小鼠正常痛阈值各测2次，每次间隔10 min，取其平均值为给药前正常痛阈值。给药除阳性对照组皮下注射盐酸吗啡溶液2 d外，其余各组同“2. 2. 1”项。末次给药后30、60、90、120 min各测小鼠痛阈值，如果用药后放入热板60 s仍无反应，即将小鼠取出，以免时间太长把脚烫伤，其痛阈值按60 s计算。

2.3.2 醋酸扭体法[7-8]

小鼠96只，雌雄各半，按体质量和性别随机分为8组，每组12只，组别及给药同“2. 2. 1”项。末次给药后1 h，各鼠均腹腔注射0.6%醋酸0.2 mL/只（醋酸溶液临用前配制）。记录各组小鼠腹腔注射醋酸后15 min内扭体反应（腹部收缩内凹、伸展后肢）次数，并计算抑制率。

抑制率（%）=（模型组扭体反应次数－给药组扭体反应次数）/模型组扭体反应次数×100%。

2.4 统计学处理

3 结果

3.1 对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响

与模型组相比，大叶胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低剂量（生药10.0、5.0、2.5 g/kg）组对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀均有明显抑制作用（< 0.01），且耳肿胀抑制率与剂量呈正相关；阿司匹林0.5 g/kg对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀也具有显著抑制作用（< 0.01）。大叶胡枝子根皮水提物高、中、低剂量作用强度与阿司匹林比较，差异无统计学意义（> 0.05）。大叶胡枝子根皮水提物与相同剂量醇提物组比较，差异有统计学意义（< 0.01），显示水提物作用强于醇提物。结果见表1。

表1 大叶胡枝子根皮提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响（, n = 12）

注：与模型组比较，**< 0.01；与阿司匹林组比较，#> 0.05；与相同剂量醇提物组比较，&&< 0.01

3.2 对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响

与模型组相比，大叶胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低剂量（生药10.0、5.0、2.5 g/kg）组和阿司匹林0.5 g/kg对蛋清所致大鼠足跖肿胀有明显抑制作用（< 0.01）。大叶胡枝子根皮水提物高剂量组给药后1、4、6 h作用强度与阿司匹林比较，差异无统计学意义（> 0.05）。大叶胡枝子根皮水提物高、中、低剂量组给药后与相同剂量的醇提物组比较，抑制大鼠足跖肿胀更明显（< 0.05、0.01），显示水提物作用强于醇提物。结果见表2。

表2 大叶胡枝子根皮提取物对蛋清致大鼠足跖肿胀的影响（, n = 10）

注：与模型组比较，**< 0.01；与阿司匹林组比较，#> 0.05；与相同剂量醇提物组比较，&< 0.05&&< 0.01

3.3 对大鼠棉球肉芽肿的影响

与模型组相比，大叶胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低剂量（生药10.0、5.0、2.5 g/kg）组和阿司匹林0.5 g/kg对大鼠棉球肉芽肿慢性炎症均有显著抑制作用（< 0.01）。大叶胡枝子根皮水提物高、中、低剂量与醇提物高剂量作用强度与阿司匹林比较，差异无统计学意义（> 0.05）。大叶胡枝子根皮水提物与相同剂量醇提物组比较，差异有统计学意义（< 0.05、0.01），显示水提物作用强于醇提物。结果见表3。

表3 大叶胡枝子根皮提取物对大鼠棉球肉芽肿的影响（, n =10）

注：与模型组比较，**< 0.01；与阿司匹林组比较，#> 0.05；与相同剂量醇提物组比较，&< 0.05&&< 0.01

3.4 对热板法致小鼠疼痛的影响

与模型组相比，给药前各组痛阈值差异无统计学意义（> 0.05）；大叶胡枝子根皮水提物高、中、低剂量（生药10.0、5.0、2.5 g/kg）组和醇提物高、中剂量（生药10.0、5.0 g/kg）组给药后60、90、120 min明显提高热板所致小鼠的痛阈值（< 0.05、0.01），醇提物低剂量（生药2.5 g/kg）组给药后90、120 min明显提高热板所致小鼠的痛阈值（< 0.05），且具剂量依赖性；吗啡溶液（0.02 g/kg）组给药后30、60、90、120 min显著提高热板所致小鼠的痛阈值（< 0.01）。

与自身给药前相比，模型组差异无统计学意义（> 0.05）；大叶胡枝子根皮水提物高、中、低剂量（生药10.0、5.0、2.5 g/kg）组和醇提物高、中剂量（生药10.0、5.0 g/kg）组给药后60、90、120 min明显提高热板所致小鼠的痛阈值（< 0.05、0.01），醇提物低剂量（生药2.5 g/kg）组给药后90、120 min明显提高热板所致小鼠的痛阈值（< 0.01）。结果见表4。

表4 大叶胡枝子根皮提取物对小鼠热板法痛阈值的影响（, n =12）

注：与模型组比较，*< 0.05**< 0.01；与自身药前痛阈比较，#< 0.05##< 0.01；

3.5 对醋酸致小鼠扭体反应的影响

与模型组相比，大叶胡枝子根皮水提物和醇提物高、中、低剂量（生药10.0、5.0、2.5 g/kg）组和阿司匹林0.5 g/kg均能明显减少醋酸所致小鼠扭体反应次数（< 0.05、0.01）。大叶胡枝子根皮水提物高、中、低剂量组给药后与相同剂量的醇提物组相比，扭体反应次数明显减少（< 0.01），显示大叶胡枝子根皮水提物作用强于醇提物。结果见表5。

表5 大叶胡枝子根皮提取物对小鼠扭体次数的抑制作用（, n =12）

注：与模型组比较，*< 0.05**< 0.01；与相同剂量醇提物组比较，&&< 0.01

4 讨论

二甲苯所致小鼠耳廓肿胀及蛋清所致大鼠足跖肿胀是以水肿和渗出为主的急性炎症反应[9]。实验结果显示，大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药明显减轻二甲苯所致小鼠耳廓肿胀，可明显抑制蛋清所致大鼠足跖肿胀，表明大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药对急性炎症具有显著抑制作用。另外，本实验也采用大鼠棉球肉芽肿模型来探讨大叶胡枝子根皮对慢性炎症反应的作用，实验结果显示大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药可显著抑制大鼠肉芽肿增生，表明大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药对慢性炎症也具有显著抑制作用。

在镇痛实验中，我们采用了热板法和扭体法进行实验。小鼠热板实验是通过一定温度（55 ℃）刺激小鼠足部以产生疼痛反应，可表现为跳跃、缩足或舔足反应。常以热刺激开始至出现舔后足反应的时间（即潜伏期）为测痛指标[10]，并以此作为评价药物的镇痛作用。本实验显示大叶胡枝子根皮提取物能明显提高热板法所致小鼠的痛阈值，这表明大叶胡枝子根皮对温度等物理因素导致的疼痛有镇痛作用。热板反应有高位中枢参与[11]，这也说明大叶胡枝子根皮有一定中枢性镇痛作用。

醋酸是一种刺激性化学物质，小鼠醋酸扭体实验是通过醋酸刺激脏层和壁层腹膜引起深部较大面积、较长时间的炎性疼痛，表现为扭体反应，这是筛选弱镇痛药的一种简便、敏感、重复性好的方法[11]。醋酸介导的伤害性反应可能由于腹腔pH值降低而直接刺激传入神经纤维和炎症介质合成共同作用导致[12]。本实验中，大叶胡枝子根皮提取物能明显减少醋酸诱发的小鼠扭体反应，提示大叶胡枝子根皮提取物对于炎症性疼痛有一定的镇痛作用。

实验结果也表明，大叶胡枝子根皮提取物在抗炎、镇痛作用方面，作用其强度与剂量呈正相关，而其水提物作用强于醇提物。

综上所述，本研究采用了3种炎症动物模型和2种疼痛动物模型来研究大叶胡枝子根皮提取物的抗炎镇痛作用。实验结果表明，大叶胡枝子根皮提取物灌胃给药对急、慢性炎症均具有良好的抑制作用；在镇痛方面，无论是物理性疼痛，还是炎症性疼痛都具有明显的镇痛作用，而且兼有良好的中枢和外周镇痛活性；在抗炎镇痛方面水提物作用强于醇提物，这和人们平时用水煎药的习惯一致。本实验结果为其综合开发利用提供了一定的实验依据。其抗炎镇痛有效部位、活性成份及作用机制等有待于进一步研究。

[1] 曹平,张兰胜. 胡枝子属植物研究进展[J]. 湖北农业科学, 2017, 56(13): 2406-2409, 2457.

[2] 江苏新医学院. 中药大辞典[M].上海:上海人民出版社, 1977: 2825-26.

[3] Wang M S, Li J R, Liu W G. Two flavanones from the root bark of[J]. Phytochemistry, 1987, 26(4): 1218-1219.

[4] Li J R, Wang M S. Two flavanones from the root bark of Lespedeza davidii[J]. Phytochemistry, 1989, 28(12): 3564-3566.

[5] 申文吉,李景荣,丁南平,等. 大叶胡枝子化学成分的研究[J]. 中国药科大学学报, 1991, 22(3): 148-149.

[6] 张颂,张宗禹,刘桦,等. 大叶胡枝子根皮中鞣质对小鼠的抗早孕作用[J].中国药科大学学报,1990,21(1): 57-58.

[7] 梁生林,梁琼,钟卫华,等. 荭草提取物抗炎镇痛作用实验研究[J]. 中草药, 2014, 45(21): 3131-3135.

[8] 钟卫华,罗辉,苏丹丹,等. 陆英不同部位水提液抗炎镇痛作用的比较研究[J]. 井冈山大学学报:自然科学版, 2018, 39(3): 88-92.

[9] Garbacki N, Gloguen V, Damas J, et al. Inhibition of croton oil-induced oedema in mice ear skin by capsular polysaccharides from cyanobacteria[J]. Naunyn- Schmiedebergs archives of pharmacology, 2000, 361(4): 460-464.

[10] 陈奇. 中药药理研究方法学[M]. 2版.北京: 人民卫生出版社, 2006.

[11] 徐叔云,卞如濂,陈修. 药理实验方法学[M]. 3版.北京:人民卫生出版社, 2005.

[12] 张凤云,库宝善,姚海燕,等. Indoxacarb的镇痛抗炎效应[J]. 中国临床康复, 2006, 10(30): 115-117.

ANTI-INFLAMMATORY AND ANALGESIC EFFECTS OF THE ROOT BARK EXTRACT OF

ZHONG Wei-hua1,*LIANG Sheng-lin2

(1. Affiliated Hospital of Jinggangshan University, Jiangxi, Ji´an 343000, China; 2. Faculty of Medicine, Jinggangshan University, Ji’an, Jiangxi 343009, China)

To investigate the anti-inflammatory andanalgesic effects of the root bark extract ofby intragastric administration.The anti-inflammatory animal models were used in researching the effects oftheextract on acute and chronic inflammation. The acute models were xylene-induced ear edema and egg white-induced pawedema, while the chronic one was granuloma induced bycotton pellet implantation. Meanwhile, the analgesic effects of that extract were observed by hot plate and acetic acid writhing test.Compared with the model group, high, middle and low doses of the root bark water extract and alcohol extract ofcould significantly inhibit ear edema in mice (< 0.01) and the paw edema in rat (< 0.01). Also, the water and alcohol extract decreased the granuloma of rats (< 0.01). Moreover, the pain thresholdwith hot plate method was significantly increased (< 0.05, 0.01) compared with the modelgroup and the data before the drugs administration of high, middle and low doses of the water extract and alcohol extract. And contrasted to the model group after extract administration, the writhing number was reduced (< 0.05, 0.01). However, there were substantial variations in the water extract groups and the same dose of alcohol extract in high, middle and low concentrations (< 0.05, 0.01).The root bark extract ofpossesses the anti-inflammatory andanalgesic effects, and water extract were better than alcohol extracts.

the root bark of; extract; intragastric administration; anti-inflammatory;analgesic

1674-8085(2019)01-0082-06

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.01.017

2018-09-29；

2018-10-19

国家科技支撑计划项目子课题项目(2012BAC11B02)

钟卫华(1976-)，女，江西吉安人，副主任医师，主要从事B超临床及中草药研究(E-mail: 269568714@qq.com);

*梁生林(1962-)，男，江西吉安县人，教授，主要从事中草药药理及毒理研究(E-mail: slliang1962@163.com).