闽北十县市钩藤中钩藤碱与异钩藤碱的含量比较研究

江 芳，郭 娜，谢茹胜

闽北十县市钩藤中钩藤碱与异钩藤碱的含量比较研究

*江 芳1,2，郭 娜1,2，谢茹胜1,2

（1. 福建生物工程职业技术学院，福建，福州 350007；2. 福建生物工程职业技术学院院士专家工作站，福建，福州 350007））

通过比较分析福建闽北地区十县市的钩藤资源中钩藤碱与异钩藤碱的含量情况，为筛选闽北地区良好的钩藤种质资源提供依据。采用高效液相色谱方法测定不同种质资源钩藤中钩藤碱与异钩藤碱的含量。不同种质资源的钩藤中钩藤碱与异钩藤碱的含量差异性较大，其中钩藤碱与异钩藤碱含量最高的是武夷山的钩藤，含量最低的是松溪县的钩藤。不同种质来源的钩藤中钩藤碱与异钩藤碱的含量差异较大，提示引种闽北各县市钩藤时应注意不同种质资源来源，同时为福建闽北本土的钩藤引种提供依据。

种质资源；钩藤；钩藤碱；异钩藤碱；比较分析

钩藤为中医临床常用中药，中国药典规定为茜草科（Rubiaceae）钩藤属（Uncaria）植物钩藤、大叶钩藤、毛钩藤、华钩藤和无柄果钩藤（白钩藤）的带钩茎枝，其中福建地区有分布的是钩藤及大叶钩藤两种。钩藤入药有着悠久的历史，具有清热平肝、息风定惊等功效[1]。药理实验表明：钩藤具有很好的降压作用，而且研究也主要集中在钩藤碱和异钩藤碱成分。因此，本研究采用高效液相色谱法（HPLC）对在同一生态环境条件下种植、采收时间和加工方法相同、种质资源不同的闽北钩藤进行钩藤碱与异钩藤碱的含量进行测定，开展有效成分钩藤碱与异钩藤碱的品质评价，为钩藤在闽北本土良种筛选、引种提供科学依据。

1 仪器与材料

日本岛津LC-2030C分析型高效液相仪，SPD-M20A二极管阵列检测器；Lab-solution数据处理系统；色谱柱：Gracesmart RP18柱（5 μm，250 mm × 4.60 mm）；AL204电子分析天平，水为超纯水（明澈TM-D 24UV超纯水机）；乙腈，色谱纯，德国Merk公司。其他试剂均为分析纯，国药化试。对照品钩藤碱购自aladdin（批号：K1510037），异钩藤碱购自中检所（批号：111927-201403）。

钩藤种质资源幼苗均于2016年3月分别采自福建闽北地区的邵武、光泽、建阳、建瓯、武夷山、浦城、松溪、顺昌、政和、南平十县市，挑选各地野生、根系完整新鲜、无机械损伤的幼苗，与贵州省引种的钩藤品种共同在福建邵武的南武夷药博园培育种植，经过近一年的培育，于当年11月采集新鲜带钩茎枝晾晒而得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

流动相：以乙腈为流动相A，以水（含1 mL·L-1三乙胺，冰醋酸调节pH 7.5）为流动相B，梯度洗脱（0～20 min，40%A→ 50%A）；检测波长：254 nm；流速：1 mL·min-1；柱温：25℃；进样量为20 μL。对照品及样品色谱图见图1、图2。

图1 异钩藤碱与钩藤碱混合对照品HPLC色谱图

图2 供试品HPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备

精密称取钩藤碱11.76 mg、异钩藤碱12.28 mg，加入乙腈配制成浓度分别为47.04 μg·mL-1，49.14 μg·mL-1的对照品溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备

取样品中粉约2.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入氨水2 mL，闷润30 min，加密加入乙腈50 mL，称定重量，加热回流提取2 h，冷却，再称定重量，用乙腈补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察

精密吸取2.2.1下的钩藤碱、异钩藤碱对照品溶液配制成一系列标准浓度的混合对照品溶液，其中钩藤碱的浓度分别为0.0470、0.2352、1.1760、2.3520、4.7040、9.4080、18.8160 μg·mL-1，异钩藤碱的浓度分别为0.0491、0.2457、1.2286、2.4572、4.9144、9.8288、19.658 μg·mL-1。按2.1色谱条件进样，测定色谱峰面积。以进样浓度C（μg·mL-1）为横坐标，色谱峰面积A为纵坐标，进行线性回归。钩藤碱标准曲线回归方程为：A= 42497C-590.11，r = 0.9999；异钩藤碱标准曲线回归方程为：A= 44708C+ 931.1，r = 1.0000。

2.3.2 精密度试验

分别精密吸取2.2.1项下对照品溶液20 μL，连续进样6次，结果钩藤碱、异钩藤碱峰面积的RSD（= 6）分别为0.13%、0.08%。表明精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液20 μL，分别于0、4、8、12、24 h进样测定，结果钩藤碱、异钩藤碱峰面积的RSD（= 6）分别为0.21%、0.17%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.4 回收率试验

称取已知含量的（贵州）钩藤粗粉6份，约1.0 g，精密称定，分别精密加入钩藤碱、异钩藤碱对照品溶液0.5、2.5 mL，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样20 μL测定，计算钩藤碱、异钩藤碱的回收率，平均回收率分别为100.9 %、100.3%。结果见表1、表2。

表1 钩藤碱加样回收率试验结果（n = 6）

表2 异钩藤碱加样回收率试验结果（n = 6）

2.4 样品测定

精密称取贵州及闽北十县市的钩藤样品，按照2.2.2项下方法制备供试品溶液，进样20 μL，计算钩藤碱、异钩藤碱的含量。测定结果见表3 。

表3 钩藤样品中钩藤碱、异钩藤碱的含量

3 讨论

据文献报道，生物碱类是钩藤中含量较多的成分，带钩茎枝总碱含量高（平均为0.22%），多为吲哚类生物碱，其中含量较高的成分是钩藤碱和异钩藤碱[2]，是钩藤类药材中的共有成分，具有较高的专属性和明确的生物活性，因此选择钩藤碱与异钩藤碱作为测定的指标成分。钩藤生物碱多采用溶剂提取法，提取之前多采用浓氨水闷润药材，而后可选用氯仿、苯、乙醚、乙醇、甲醇、乙腈等有机溶剂提取。有文献报道钩藤碱、异钩藤碱在极性溶剂中易发生相互转化[3]，因此，可选择同时测定钩藤碱、异钩藤碱的含量或者两者之和来评价闽北十县市不同种质资源的钩藤样品的优劣。

王英峰等[4]研究表明，溶剂极性越大则总碱中钩藤碱含量越低，异钩藤碱含量越高。李思蒙等通过对比不同的提取方法[5]，发现钩藤经氨水碱化后用乙腈直接回流提取，异钩藤碱的提取率可达到95%，并且可以直接进样用于HPLC和UPLC分析。从最终实验结果可以看出，异钩藤碱的含量比钩藤碱的含量高，是钩藤碱含量的4~5倍，说明钩藤经氨水碱化后采用极性较大的乙腈作为提取溶剂回流提取，更有利于异钩藤碱的提取溶出，因此其含量更高，与相关文献报道一致。

同时结合文献报道的HPLC法测定钩藤碱或异钩藤碱含量的方法，主要选用了两种流动相[5-6]，一种是以乙腈为流动相A，以水（含1mL·L-1三乙胺，冰醋酸调节pH 7.5）为流动相B，梯度洗脱（0~20 min，40%A→ 50%A）；另一种是以甲醇-水（70 : 30）（含0.01 mol·L-1三乙胺，冰醋酸调节pH 7.5），实验对比了该两种流动相，发现前者分离效果更佳，因此本实验选用前者方法。

闽北十县市不同种质资源的钩藤样品均于同一时期采集、引种，经过相同培育时间，同时期采收新鲜带钩茎枝晾晒而得。与引种自贵州的钩藤品种相比较，闽北十县市不同种质资源的钩藤中钩藤碱与异钩藤碱的含量差异性较大，其中钩藤碱与异钩藤碱的含量最高的是武夷山的钩藤，可能与武夷山优越的自然生态环境有关；含量最低的是松溪县的钩藤。武夷山、光泽钩藤样品中含有的钩藤碱及异钩藤碱的含量较贵州省品种高，而其他地区的样品中其含量都更低。所以在引种闽北钩藤品种时，提示引种闽北各县市钩藤时应注意不同种质资源来源，注重生态环境对种质资源的影响，同时为福建闽北本土的钩藤良种筛选、引种提供科学依据。

[1] 中国科学院中国植物志编辑委员会. 中国植物志[M]. 北京:科学出版社,1999:255.

[2] 王瑞俭,孙广仁,孙宝民. 钩藤碱提取工艺研究[J]. 吉林林学院学报,1998,14(2): 109-111.

[3] 原田正敏. 日本常用中药的定量分析-防己、钩藤[J]. 国外医药－植物药分册,1991,6(5): 219.

[4] 王英峰,魏璐雪,王保中. 高效液相色谱法测定钩藤中钩藤碱、异钩藤碱含量[J]. 药物分析杂志,1999,19(1): 56-57.

[5] 李思蒙,侴桂新. 钩藤药材中异钩藤碱含量的超高效液相色谱和高效液相色谱法测定[J]. 时珍国医国药,2010, 21(12): 3195-3197.

[6] 王晓颖,刘永静,陈丹,等. HPLC法测定不同产地钩藤中钩藤碱的含量分析[J]. 中国中医药科技,2011,18(3): 215-216.

RHYNCHOPHYLLINE AND ISORHYNCHOPHYLLINE CONTENTS INOF VARIOUS GERMPLASM RESOURCES IN NORTHERN FUJIAN: A COMPARATIVE STUDY

*JIANG Fang1,2, GUO Na1,2, XIE Ru-sheng1,2

(1. Fujian Vocational College of Bioengineering, Fuzhou, Fujian 350007, China; 2. Academician Expert Workstation, Fujian Vocational College of Bioengineering, Fuzhou, Fujian 350007, China)

To investigate the rhynchophylline and isorhynchophylline contents inof various germplasm resources.Rhynchophylline and isorhynchophylline contents inof various germplasm resources were determined using high-performance liquid chromatography (HPLC).There weregreat differences about rhynchophylline and isorhynchophylline contents among various germplasm resources, the highest contents were determined in the sample from Wuyishan, the lowest from Songxi.The significant differences among various germplasm resources ofsuggested that attention should be paid to different sources of germplasm resources when the introduction was carried out, and the results could provide theoretical basis for the introduction of localin northern Fujian.

germplasm resource;; rhynchophylline; isorhynchophylline; comparative analysis

1674-8085(2019)01-0103-04

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2019.01.020

2018-09-11；

2018-11-16

福建省教育厅计划项目（JAT171013）；福建省教育厅健康平台运行及项目建设（2017CZ05-2）

*江芳(1982-），女，福建邵武人，讲师，硕士，主要从事中药化学及中药制剂分析研究(E-mail:67282313@qq.com);

郭娜(1986-），女，福建龙岩人，讲师，硕士，主要从事植物资源与植物生态研究(E-mail:348103196@qq.com);

谢茹胜(1978-），女，福建漳州人，副教授，硕士，主要从事分析化学与海洋活性成分研究(E-mail:429457438@qq.com).