化瘀生新合剂制备工艺优化△

杨小催，郭彩娥，沈祖泓

清远市中医院，广东 清远 511500

化瘀生新合剂处方来源于清远市中医院妇产科章青英教授临床经验方“产后方”，该方由党参、黄芪、当归、川芎等8味药材组成，具有益气固涩、祛瘀止血、温经止痛之功能，在院内临床使用十多年，用于产后子宫复旧及瘀血不尽、冲任不固所致的产后恶露不绝，疗效明确，可显著降低宫底高度，促进恶露排出，提高子宫复旧效果。该处方原为汤剂内服，临床疗效较好，但存在煎煮、携带、使用不方便的缺点，结合预试验结果和医院实际条件，拟制备成合剂，其具有起效快，服用和携带方便等优点，适合病人服用，可以满足临床用药和制剂生产需要。

通过文献资料研究发现，方中当归、川芎、白术、炮姜发挥功能的有效成分主要存在于挥发油和水提取液中，党参、黄芪等药材主要为水溶性成分，结合本处方在临床运用中一直以汤剂入药有效的现状，确定提取工艺为当归、川芎、白术、炮姜先提取挥发油[1]，其药渣再与党参等四味药材共同水煎提取。通过正交试验[2-3]，以君药黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量以及固形物总质量作为评价指标，优选水提工艺，并对其浓缩工艺和成型工艺进行考察，为该制剂的临床使用、成批生产提供参考。

1 材料

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪；Waters2489紫外监测器；瑞士梅特勒METTLER XS205电子分析天平；美国丹佛TP-114型分析天平；DHG-9023A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备)；电热恒温水浴锅(北京永光明医疗设备)；上海安亭LXJ-11B离心机。

1.2 试药

毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111920-201203)；乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂为分析纯。

所有药材均购自广东众康药业有限公司，并经检验鉴定符合《中华人民共和国药典》2015版一部各项下规定。

2 方法与结果

2.1 单因素筛选挥发油提取工艺

经预试验，当归、川芎、白术、炮姜含有的挥发油相对密度与水接近，按照2015版《中华人民共和国药典》四部220项挥发油提取乙法进行挥发油的提取。

2.1.1 吸水率 按处方比例，称取当归、川芎、白术、炮姜饮片3份，每份230 g，分别加8倍量的水浸泡，浸泡过夜，至药材全部浸透，滤过，称取湿药材的质量，计算药材吸水率，结果药材的平均吸水率为272.61%，为考察加水倍量提供了参考。

2.1.2 浸泡时间 按处方比例，称取当归、川芎、白术、炮姜饮片3份，每份230 g，分别置3000 mL圆底烧瓶，加入8倍量的水浸泡，分别浸泡0、1、2 h后，加热回流提取挥发油8 h，记录挥发油提取量分别是0.51、0.52、0.51 mL，收油量无显著差别，因此无需浸泡。

2.1.3 加水量 按处方比例，称取当归、川芎、白术、炮姜饮片共4份，每份230 g，分别置3000 mL圆底烧瓶，分别加入4、6、8、10倍量水，加热回流提取挥发油8 h，记录挥发油提取量分别为0.44、0.48、0.52、0.51 mL，确定加水量为8倍量。

2.1.4 提取时间 按处方比例，称取当归、川芎、白术、炮姜饮片共3份，每份230 g，分别置3000 mL圆底烧瓶，加入8倍量水，加热回流提取挥发油8 h，记录2、3、4、5、6、7、8 h的挥发油收集量分别为0.09、0.23、0.37、0.48、0.51、0.51、0.51 mL，确定提取时间为6 h。

2.1.5 挥发油提取工艺验证试验 根据单因素筛选试验中确定的各最佳条件进行3批试验验证。分别按处方比例，称取当归、川芎、白术、炮姜饮片3份，每份230 g，分别置3000 mL圆底烧瓶，加入8倍量水，加热回流提取6 h，记录挥发油的总收集量分别为0.51、0.52、0.52 mL，与优选实验结果相近，说明工艺优选条件合理，提取工艺稳定可靠。

2.2 水提工艺优选

采用正交试验法，以毛蕊异黄酮葡萄糖苷(以下简称“指标成分”)含量和固形物质量为考察指标，对影响提取效果的加水量、提取时间和提取次数进行优选。其因素水平设计见表1。

表1 因素水平表

2.2.1 样品制备 按处方比例，称取饮片9份，每份242 g，当归、川芎、白术、炮姜照优选工艺提取挥发油，药液另存，药渣与其余四味饮片按正交试验表L9(3)4安排的方法进行提取，滤过，滤液浓缩并定容至250 mL，测定浓缩液中指标成分含量和固形物质量。

2.2.2 固形物质量测定 精密吸取各样品浓缩液50 mL，置干燥的蒸发皿中，照浸出物测定法测定，计算固形物质量，结果见表2。

固形物质量(g)=[W(g)×V(mL)]/50(mL)

(1)

注：W为50 mL浓缩液中固形物质量，V为定容体积。

2.2.3 毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量测定 色谱条件：XBridgeTMC18色谱柱，流动相为0.2%甲酸-乙腈(88∶12)；柱温：25 ℃，波长：260 nm。

对照品溶液的配制：取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为87 μg·mL-1的溶液，即得。

供试品溶液的制备：精密吸取浓缩液1 mL，至5 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理30 min，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

阴性对照溶液的制备：取处方中除黄芪外的其他药材，按供试品溶液制备的方法制得阴性对照溶液。

标准曲线的绘制：分别精密吸取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(质量浓度为87 μg·mL-1)1、2、3、5、7、8 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，分别制得质量浓度为8.70、17.40、26.10、43.5、60.9、69.6 μg·mL-1的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液，精密吸取各对照品溶液8 μL进样，测定峰面积，以峰面积为纵坐标，以含量为横坐标，得回归方程：Y=2.967X-44.31；r=0.999 7。结果显示，毛蕊异黄酮葡萄糖苷在进样量69.59～556.71 ng呈良好的线性关系。

专属性试验：吸取上述对照品、供试品及阴性对照溶液10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图(见图1)。结果显示，阴性对照图谱与对照品、供试品图谱中毛蕊异黄酮葡萄糖苷相应的保留时间无其他峰干扰，表明选择性良好，阴性无干扰。

测定法：分别精密吸取各供试品溶液10 μL，注入液相色谱仪，测定。

注：A.毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液；B.阴性对照溶液；C.供试品；S.毛蕊异黄酮葡萄糖苷。图1 化瘀生新合剂HPLC图

2.2.4 数据处理 采用综合评分法，结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验结果

综合评分=指标成分含量i/指标成分含量max×50×100%+水溶性固形物质量i/水溶性固形物质量max×50×100%

(2)

表3 方差分析结果表

注：F0.1(2，2)=9.00；F0.05(2，2)=19.00。

由直观分析可见，影响提取效果的因素顺序为：提取次数(C)>加水倍量(A)>提取时间(B)。方差分析结果表明，因素C和因素A对结果的影响差异有统计学意义(P<0.05和P<0.10)，因素B对结果的影响差异无统计学意义，综合考虑生产效率和节能等各方面因素，确定的优选工艺组合为A2B1C2，即药材饮片提取2次，每次加水8倍量，每次提取1 h。

2.2.5 验证试验与结果 按处方比例，称取药材3份，每份242 g，当归、川芎等四味药材加8倍量水，加热回流提取6 h，收集挥发油，药液保留，药渣与其他药材按照上述优选的水提工艺条件进行提取，滤过，滤液与提油后的药液合并，浓缩，定容至250 mL，测定指标成分的含量和水溶性固形物质量，计算综合评分平均值为97.96，RSD为2.37%，与正交试验最大综合评分值接近，说明正交试验选出的工艺条件合理，工艺条件稳定可行。

2.3 浓缩工艺考察

2.3.1 样品的制备 按提取验证工艺条件制备提取液两份(指标成分质量浓度为3.856 μg·mL-1)，每份9.15 kg，一份置旋转蒸发仪中减压浓缩(浓缩条件为：-0.085 Mpa，60 ℃)，另一份常压浓缩，将提取液浓缩至相对密度约1.10(60 ℃)，记录此时浓缩液的相对密度和质量；取样，测定浓缩液中指标成分的含量，计算保留率。结果见表4。

指标成分保留率(%)=

(3)

2.3.2 样品中指标成分的含量测定 提取液供试品溶液的制备：称取1 g提取液，精密称定，通过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液即得。

浓缩液供试品溶液的制备：精密移取浓缩液1 g，至5 mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理20 min，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得，结果见表4。

表4 不同浓缩方法对指标成分含量的影响

结果显示，减压浓缩工艺比常压浓缩工艺的指标成分保留率要高，因此确定本品的浓缩方式为减压浓缩。

2.3.3 浓缩液除杂工艺考察 取相对密度为1.10(60 ℃)的浓缩液两份，每份约300 mL，一份置离心机中(5000 r·min-1)离心除杂10 min，取上清液加纯化水至400 mL；另一份用200目筛滤过，滤液加水至400 mL。将所述两种除杂药液冷藏7 d，观察沉淀情况，结果表明，采用离心除杂与滤过除杂所产生的沉淀均可摇散，但采用离心除杂药液所产生的沉淀物少于采用滤过除杂药液所产生的沉淀物，因此确定本品浓缩液除杂方法采用5000 r·min-1离心除杂法。

3 成型工艺研究

3.1 矫味剂用量的筛选

本品提取物具有一定的苦、涩味，部分患者服用时难以接受，需添加一定量的甜味剂对药物进行矫味，以增加患者服用的依从性。本制剂选择具有《中华人民共和国药典》标准的蔗糖作为甜味剂。试验以药液口感为指标，取浓缩液412 mL(相当于493 g药材)，加入1.5 g苯甲酸钠，加热至沸并保温30 min，冷藏24 h，滤过，滤液加入50 mL芳香水溶液，搅匀，均分为5份，分别按表5所示加入蔗糖，搅拌使溶解，加入纯化水至100 mL，用口尝之，并观察药液外观。结果表明，当蔗糖加入量为制成量的2.8%时，合剂口感得到改善，确定本品蔗糖用量为制成量的2.8%。

3.2 抑菌剂种类及其用量的选择

3.2.1 抑菌剂的选择 本品药液pH值在4.5左右，可选择苯甲酸钠作为抑菌剂。

3.2.2 抑菌剂用量的确定 参照制剂通则中合剂(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则0181)[4]第2条使用限量的规定，即“苯甲酸的用量不得超过0.3%(其钾盐、钠盐的用量分别按酸计)”。试验拟定本品处方中苯甲酸钠用量为0.2%和0.3%。并按照抑菌效力检查法(《中华人民共和国药典》2015年版四部通则1121)，测定该抑菌剂加入量样品的抑菌效力，结果见表5。

表5 确定处方样品的抑菌效力测定结果

结果表明，本品确定的处方中，苯甲酸钠用量为制成量的0.3%时，制剂符合制剂通则中合剂使用限量和抑菌效力的规定。

4 讨论

化瘀生新合剂处方是本院妇产科章青英教授根据产妇多虚多瘀之特点，在“生化汤”[5]基础上，结合临床多年应用总结出的经验方，兼具生新和化瘀两方面的作用。古人将生化汤称为“血块圣药”。对产后恶露不下、恶露不绝、腹痛可消块止痛，促进气血恢复，加速子宫的收缩，利于机体的康复[6]。《血证论》[7]云：“凡系离经之血与荣养周身之血，已暌绝而不合，此血在身，不能加于好血，而反阻新血之化机。瘀不去，则血不止，旧血不去，新血不生”；《胎产心法》[8]论述：“产后恶露不止，由于产时伤其经血，虚损不足，不能摄血或恶血不尽则好血难安，向并而下，日久不止”。

化瘀生新方中党参益气补虚，当归补血活血、祛瘀生新，二者为君；黄芪、白术补中益气，川芎、桃仁活血行气，共为臣；益母草活血祛瘀为佐药；炮姜温经止痛为使。诸药合用可起到益气固涩、祛瘀止血、温经止痛之功。

为遵循传统成方煎煮方法，最大限度保证制剂疗效，在提取方法的选择上，我们采用与该方多年临床应用相同的方法：水提法。又考虑到本处方中部分药味的挥发油成分具有调经止痛、抗炎等作用，可提高化瘀血、生新血的疗效，促进产后恢复，如当归、川芎中的挥发油具有镇痛作用，能促进细胞增殖[9]，能调节子宫平滑肌收缩，解除痉挛而达到调经止痛功能[10]，还具有舒张胃肠及主动脉平滑肌，降低肌张力的作用[10-11]。白术挥发油对于胃肠运动具有促进作用，使小肠推进率显著提高，还能调节免疫功能，利胆，镇静镇痛[12]；炮姜的挥发油成分能使周围血管扩张、促进血液循环；能抑制血小板凝集、抗血栓；还具有抗炎、抗凝血作用[13]。因此，本试验选择先将当归、白术、川芎、炮姜提取挥发油，药渣与其他药味再水提的提取方法。

结果发现，当归、川芎、白术、炮姜提取的混合挥发油相对密度与水接近，在水中的分散性也较好，将挥发油与其他药液混合振摇后，即可较均匀地分散在药液中，药液放凉后亦不会上浮，凝聚。且在实际的制剂生产过程中，挥发油的提取是以挥发油水溶液的方式收集，油量小，在水中的分散较好。故本制剂中的挥发油在制剂定容前与其他药液混合，搅匀即可，无需另外添加表面活性剂等其他增溶剂。