鹿茸-山药药对补肾壮阳作用研究△

李晶峰，边学峰，牛晓晖，孙佳明，孔庆国，张辉*

1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.长春工业大学，吉林 长春 130012；3.吉林省医疗器械检验所，吉林 长春 130062

鹿茸为脊索动物门哺乳纲鹿科的动物梅花鹿CervusNipponTemminck或马鹿CervuselaphusL.的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角[1]，主要用于肾阳不足、精血亏虚，为温肾壮阳、补督脉、益精血的要药[2-4]，具有抗肿瘤[5]、强筋骨[6-8]之功效。山药是薯蓣科多年蔓生草本植物薯蓣DioscoreaoppositaeThunb.干燥根茎，为传统的补益中药，有健脾养胃、补肺益肾、止泻利湿等功能[9-10]，有抗氧化[11-13]、抗肿瘤及雌激素样作用[14]。

药对又称对药，是临床用药中相对固定的两味药物的配伍形式，是两味固定中药配伍在同一方剂中应用，起到相辅相成的作用[15-16]。鹿茸-山药药对来源于《普济方》：将鹿茸(10 g)、山药(30 g)粉碎置入容器中，加入白酒(500 mL)，密封浸泡7 d以上便可服用，每日饮用15～20 mL。鹿茸-山药药对具有补肾壮阳、健脾益精的功效[17]，从古到今应用广泛。鹿茸与山药单味药的研究较多，但两药合用的研究报道较少，本文以肾阳虚大鼠为模型，探讨鹿茸-山药药对的补肾壮阳作用。

1 材料

1.1 动物

健康Wistar大鼠180～220 g，雄性，动物质量合格证编号：SCXK-(吉)2017-0004，由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。

1.2 药物与试剂

鹿茸药材采自吉林省双阳市，经长春中医药大学张辉教授鉴定为鹿科动物梅花鹿CervusnipponTemminck雄鹿未骨化的密生茸毛幼角；山药购自长春市同仁堂药店，经长春中医药大学张辉教授鉴定为薯蓣科植物薯蓣DioscoreaoppositaThunb.的干燥根茎。男宝胶囊(天津力生制药股份有限公司，批号：1705109)；地塞米松磷酸钠注射液(天津药业集团新郑股份有限公司，批号：1703054)；氢化可的松注射液(河南润弘制药股份有限公司，批号：1702211157)；丙酸睾酮(上海通用药业股份有限公司，批号：17090412)；环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、促性腺激素释放激素(GnRH)、肾上腺皮质酮(CORT)ELISA试剂盒(美国RD公司，批号：20170705A)。

1.3 仪器

Model 680型酶标仪(日本TAKARA公司)；HERAEUS HERAcell 150二氧化碳培养箱(日本三洋公司)；倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)；超净工作台(YZ-875苏州净化设备厂)；MULTISKAN FC型酶标仪[赛默飞尔(上海)仪器有限公司产品]。

2 方法

2.1 鹿茸-山药提取物的制备

取鹿茸10 g，山药30 g(均粉碎过三号筛)，混合均匀，加入400 mL 60%乙醇，超声提取3次，每次1 h，合并过滤液，滤液在水浴浓缩至干膏(1.04 g)。

2.2 动物分组与给药

雄性Wistar大鼠90只，随机分为9组：空白对照组(0.9%氯化钠溶液0.01 mL·g-1)；模型对照组[注射氢化可的松2.5 mg·(100g-1)]；中药阳性药组(男宝胶囊0.6 g·kg-1)；西药阳性药组(丙酸睾酮，10 mg·kg-1，隔天给药1次)；鹿山高剂量组(1.8 g生药·kg-1)；鹿山中剂量组(0.9 g生药·kg-1)；鹿山低剂量组(0.45 g生药·kg-1)；鹿茸组(0.4 g生药·kg-1)及山药组(1.4 g生药·kg-1)。除空白对照组与模型组外，各组大鼠造模7 d后，按照上述给药剂量开始给药，除西药对照组为隔天给药1次外，其余各组均每日给药1次，连续7 d，给药同时不造模[18-20]。末次给药后称量各组大鼠体质量变化情况。

2.3 大鼠血清中激素水平的测定

末次给药后，大鼠麻醉，腹主动脉采血，室温放置30 min后离心收集血清，-80 ℃保存。采用ELISA法检测血清中cAMP、cGMP、T、FSH、LH、GnRH和CORT水平。

2.4 大鼠性器官脏器系数的计算

末次给药后，大鼠麻醉，处死后迅速剥离前列腺、提肛肌、精液囊，称湿质量，根据器官系数=器官湿质量/体质量，计算各组大鼠性器官的脏器系数。

2.5 统计分析

3 结果

3.1 鹿茸-山药药对对氢化可的松诱导肾阳虚大鼠体质量的影响

实验结果表明，与空白对照组比较，模型组大鼠体质量显著降低(P<0.05)；鹿山低剂量组大鼠体质量显著增加，与模型比较差异具有统计学意义(P<0.05)；其他各组大鼠体质量与模型组相比差异无统计学意义，结果见图1。

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；n=10；下同。图1 鹿茸-山药药对对各组大鼠体质量的影响

3.2 鹿茸-山药药对对血清cAMP和cGMP水平的影响

与空白对照组比较，模型组cAMP及cAMP/cGMP水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中药阳性药组cAMP与cAMP/cGMP水平显著提高(P<0.05)，西药阳性药组差异无统计学意义(P>0.05)，鹿茸、山药组差异无统计学意义(P>0.05)，鹿山高剂量组cAMP与cAMP/cGMP水平显著提高(P<0.05)，鹿山中、低剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图2。

注：A.cAMP水平；B.cGMP水平；C.cAMP/cGMP水平。图2 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠血清中cAMP与cGMP水平的影响

3.3 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠血清中激素水平的影响

3.3.1 对睾酮水平的影响 与空白对照组相比，模型组T水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中药阳性药组T水平显著升高(P<0.05)，西药阳性药组差异无统计学意义(P>0.05)，鹿茸组T水平显著升高(P<0.05)，提示鹿茸具有雄激素样作用，山药组、药对组差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图3。

图3 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠血清睾酮水平的影响

3.3.2 对卵泡刺激素水平的影响 与空白对照组相比，模型组FSH水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中药阳性药组、西药阳性药组、山药组FSH水平显著提高(P<0.05)，鹿山高剂量组FSH水平提高(P<0.05)，鹿山中、低剂量组差异无统计学意义，结果见图4。

图4 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠血清卵泡刺激素水平的影响

3.3.3 对黄体生成素水平的影响 与空白对照组相比，模型组LH水平降低(P<0.05)；与模型组比较，中药阳性药组差异无统计学意义(P>0.05)，西药阳性药组LH水平升高，鹿茸组与山药组LH水平差异均无统计学意义(P>0.05)，鹿山高、低剂量组LH水平显著升高(P<0.05)，鹿山中剂量组差异无统计学意义(P>0.05)，结果见图5。

图5 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠血清黄体生成素水平的影响

3.3.4 对促性腺激素释放激素水平的影响 与空白对照组相比，模型组GnRH水平显著降低(P<0.05)；与模型组比较，中药、西药阳性药组差异无统计学意义(P>0.05)，鹿茸组可升高GnRH水平(P<0.05)，提示鹿茸可能作用于下丘脑，促进GnRH分泌改善肾阳虚症状，山药组GnRH水平无明显变化，鹿山药对组差异无统计学意义，结果见图6。

图6 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠血清促性腺激素释放激素水平的影响

3.3.5 对肾上腺皮质酮水平的影响 与空白对照组相比，模型组CORT水平显著降低(P<0.01)；与模型组相比，中药、西药阳性药组CORT水平无明显改变，鹿茸组CORT水平显著升高(P<0.05)，提示鹿茸可作用于肾上腺，促进CORT分泌，山药组、鹿山药对组CORT水平无明显改变，结果见图7。

注：与空白组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05；n=10。图7 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠血清肾上腺皮质酮水平的影响

3.4 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠性器官系数影响

3.4.1 对前列腺系数的影响 结果显示，模型组与空白对照组相比，前列腺系数显著降低(P<0.05)；与模型组相比，中药阳性药组前列腺系数显著增加(P<0.05)，西药阳性药组、鹿茸及山药组无明显变化，鹿山高剂量组显著增加(P<0.05)，鹿山中、低剂量组并无明显变化，结果见图8。

图8 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠前列腺系数的影响

3.4.2 对提肛肌+储精囊系数的影响 与空白对照组相比，模型组提肛肌+储精囊系数显著降低(P<0.05)，中药阳性药组无明显变化，西药阳性药组提肛肌+储精囊系数显著增加(P<0.05)，鹿茸组、山药组无明显变化，鹿山高剂量组提肛肌+储精囊系数显著增加(P<0.05)，提示当两味药相配伍时才能发挥协同作用增加药效，鹿山高剂量组效果优于西药阳性药组，鹿山中、低剂量组无明显变化，结果见图9。

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与西药阳性药组比较，△P<0.05；n=10。图9 鹿茸-山药药对对肾阳虚大鼠提肛肌+储精囊系数的影响

4 讨论

中医理论认为“人之根本在于肾，肾主骨生髓”，鹿茸壮肾阳、益精血，山药有填精固肾、涩精止遗之功效，鹿茸-山药药对始载于《普济方》鹿茸酒。两药合用主治虚弱阳事不举、面色不明、小便频数、饮食不思等肾阳虚证。

本实验采用氢化可的松致大鼠肾阳虚模型，其成模标准通过检测血清中cAMP与cGMP含量来筛选[21-23]。氢化可的松干预后，大鼠细胞内第二信使cAMP及cAMPc/GMP比值降低，基础代谢下降，同时抑制下丘脑对GnRH的释放以及肾上腺对CORT的分泌，使大鼠表现出肾阳虚相关表型并伴随相关指标变化[24]。本实验中，模型组与空白对照组比较，cAMP及cAMP/cGMP水平均显著下降，GnRH与CORT显著降低，与上述肾阳虚模型指标相符合，显示出下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA轴)功能被抑制[25-26]。LH通过与睾丸间质细胞上的膜受体结合促进睾酮的合成和分泌，FSH通过上调黄体生成素/人绒毛膜促性腺激素(LH/HCG)受体的表达加强LH的作用[27]。在本实验中鹿茸单味药可通过作用于下丘脑-肾上腺-性腺提高提升GnRH、CORT、T[28]水平来实现肾阳虚症状的改善，而鹿茸-山药药对并未显示对上述3个指标的显著性变化，可能是由于鹿茸与山药配伍后，对上述指标发挥药效的成分发生改变，需进一步研究；鹿茸-山药是通过增加FSH与LH水平来发挥促性腺激素样作用，药对中主要发挥提高FSH作用的是山药，且鹿茸、山药单味药均不能使LH水平显著增加，只有二者合用才能显著提升LH含量；两个单味药对性器官系数未显示出显著变化，两味药配伍后可提高前列腺系数及提肛肌+储精囊系数，具有促进雄性器官生长的作用，提示鹿茸-山药对大鼠有一定的补肾壮阳作用，且是二者共同作用发挥药效。中药阳性药通过增加肾阳虚大鼠血清中cAMP水平，使激素T、LH水平与前列腺系数提高，鹿茸-山药药对与其相比，同样可提升cAMP，但升高的激素种类不同(FSH、LH)，并能提升提肛肌+储精囊系数；西药阳性药通过提高肾阳虚大鼠垂体激素(FSH、LH)水平与提肛肌+储精囊系数产生药效，与西药阳性药相比，鹿茸-山药药对与其提高激素种类相同，并可提升前列腺系数。综上，鹿茸-山药药对组通过增加cAMP进而影响垂体-性腺轴[29-31]功能，提高垂体激素(FSH、LH)水平与性器官系数(前列腺系数及提肛肌+储精囊系数)来体现对肾阳虚大鼠的治疗作用，这是二者配伍产生协同作用的结果。

鹿茸和山药含有多种对人体有益的营养物质和活性成分，对机体功能存在诸多影响，是一种具有广泛应用前途的中药资源。随着现代科技水平的提升，我们应当利用高科技技术针对中医古籍中鹿相关的经方、验方进行筛选分析，并在明确市场经济效益机制的基础上，瞄准鹿茸和山药功能性食品和药品，确实开发出具有引领效应的产品，进而通过梅花鹿下游产品开发带动梅花鹿产业的发展，更好地为人类健康服务。